Direkte vs. indirekte ELISA: Forståelse af de vigtigste forskelle

Et enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) involverer reaktionen af et antistof-enzyme kompleks med et antigen eller antistof holdt immobiliseret på en fast overflade. Ved inkubation af det konjugerede enzym med et passende substrat, dannes et produkt. Dannelsen af et produkt hjælper med at detektere tilstedeværelsen af antigenet eller antistoffet, og dets mængde giver et mål for mængden af antigen-antistof-reaktion, der har fundet sted. ELISA-testen kan udføres i to former: direkte og indirekte.

Testformat

I den direkte ELISA-test holdes et primært antistof på væggene i en mikrotiterplade. Når prøven, der mistænkes at indeholde antigenet, tilføjes, sker der en antigen-antistof-reaktion. Derefter tilføjes et enzym-markeret sekundært antistof, der er i stand til at reagere med antigenet. Hvis antigen er til stede i prøven, binder det til dette enzym-markerede antistof. Når et farveløst substrat tilføjes, hvis en farve udvikler, indikerer det tilstedeværelsen af antigen. I den indirekte ELISA holdes antigenet på væggene i mikrotiterpladen. Når en prøve, der mistænkes at indeholde antistoffer, tilføjes, sker en antigen-antistof-reaktion. Derefter tilføjes et enzym-markeret sekundært antistof, der er i stand til at reagere med den ubundne region af antistoffet. Når det farveløse substrat tilføjes, fører det til udvikling af farve, hvis den brugte prøve indeholder antistoffer.

Lethed ved testning

Et bredt udvalg af mærkede sekundære antistoffer er kommercielt tilgængelige. Desuden er det muligt at skabe flere primære antistoffer i en given art og bruge det samme sekundære antistof til detektion. Dette gør den indirekte ELISA let at udføre. I den direkte ELISA skal de primære antistoffer specifikt præpareres til at reagere med det specifikke antigen, der mistænkes at være til stede i prøven. Dette gør den direkte ELISA uheldig i forhold til den indirekte test.

Hurtighed ved testning

Den direkte ELISA-test er hurtig i sammenligning med den indirekte test, fordi den kun bruger et enkelt antistof. Den indirekte ELISA kræver et ekstra trin med inkubation med et andet antistof under testproceduren, hvilket forårsager en forsinkelse i at få resultater.

Følsomhed

Den direkte ELISA-test er mindre følsom end den indirekte form for testen, fordi der er meget mindre signalforstærkning. Desuden kan mærkningen af det primære antistof med et enzym forringe dets immunoreaktivitetsprofil. I tilfælde af den indirekte ELISA er det primære antistof ikke mærket, og derfor bevarer det sin immunoreaktivitet. Desuden har hvert primært antistof mange epitober, der kan binde med det sekundære antistof; dette tillader forstærkning af signalet, hvilket forbedrer metodens følsomhed. Dog er der en chance for krydsreaktivitet mellem antigenet og det sekundære antistof, hvilket fører til en fejl i resultaterne. Der er ingen sådan mulighed i den direkte ELISA-metode.