Hvordan man vælger restriktionsenzymer

Restriktionsenzymer er enzymer, der skærer både enkelt- og dobbeltstrenget DNA. Hvert restriktionsenzym har en specifik nukleotidsekvens, kaldet et restriktionssted, som det genkender og skærer. Restriktionsenzymer anvendes til DNA-sekventering, mutationsanalyse og kloning og amplifikation af DNA. Forskere bruger restriktionsenzymer til at indsætte gen af ​​interesse i ekspressionsvektorer, DNA-molekyler, som kan replikere separat fra kromosomalt DNA. Vektoren indeholdende genet af interesse kan derefter introduceres i en bakteriestamme for ekspression og karakterisering af proteiner.

Identificer restriktionsenzymsteder på din vektor ved at se på et restriktionskort. Restriktionskortet fortæller hvilke enzymer der vil skære din vektor, og hvor.

Vælg et restriktionsenzym, som også har et sted til stede på din genindsats ved at se på sekvensen af indsætte. Sørg for, at begrænsningsstedet er i en position på din indsats, der er uden for genet, så du ikke mister nogen del af genet.

Sørg for, at der ikke er duplikater af restriktionssted hvor som helst i dit genindsats eller vektor. Dette vil medføre flere nedskæringer i dit DNA og give dig vildledende data.

Prøv at vælge restriktionsenzymer, der skæres med klæbrige ender, snarere end stumme ender. Klæbende ender opstår, når enzymet skærer dobbeltstrenget DNA på en forskudt måde, hvilket efterlader et enkeltstrenget overhæng, der letter vedhæftning med en indsats, der skæres på den modsatte måde. Blunt ender opstår, når det dobbeltstrengede DNA er skåret på en glat måde, og disse er sværere at vedhæfte.

Vælg et andet restriktionsenzym i begge ender af din indsats for at sikre det indsættes i vektoren i den korrekte orientering og for at sikre, at vektoren ikke genbindes til sig selv.

Prøv at vælge to restriktionsenzymer, der fungerer godt i samme buffersystem og temperatur . Hvis dette ikke er muligt, skal du køre hver fordøjelse separat.

Tip

Nogle web-programmer er udviklet til hurtigt at identificere restriktionssteder på en DNA-sekvens. Et sådant program er fra New England BioLabs.

Ting, der er nødvendige

Sekvens for genindsats

Begrænsningskort for valgfri vektor

Liste over restriktionsenzymer og deres afskårne steder