|  | Sundhed og Sygdom >  | Sygdomme og behandlinger | Urinsyregigt (gigt)

Spektrofotometrisk slutpunkts-bestemmelse for Trypsin-Casein-hydrolyse

Princip

Casein-hydrolyse → ↓ tærhed (opklart) + ↑ opløselige peptider/aminosyrer. Absorbans ved 280 nm (aromatiske AA) eller 440 nm (farvimetrisk assay med TCA/Folin) stiger, som peptider akkumulerer. Mere objektiv end visuel opklaring.

Optimeret protokol

Materialer

  • Trypsin-løsning (f.eks. 0,1 mg/mL i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM CaCl2)
  • Casein-substrat (1% w/v i samme buffer; eller azocasein til farvimetrisk)
  • Stop-løsning: 10% TCA eller 0,5 M NaOH (denaturerer trypsin)
  • Spektrofotometer + kvarts-kvetter (1 cm vejlængde)
  • Vandbad (37°C)

Procedure

  1. Forvarm substrat & enzym separat (37°C, 5 min).
  2. Initier reaktion: Bland 1 mL casein + 0,1 mL trypsin (endelig [E] defineret). Start timer.
  3. Ved intervaller (0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 min), tag 0,2 mL aliquot → 0,8 mL stop-løsning. Vortex.
  4. Centrifugér 10.000g × 5 min (fjern faldet protein).
  5. Mål overstående A280 (peptid-bindinger) eller kør Folin-Lowry/BCA på overstående for total peptid-kvantificering.
  6. Plot A280 (eller μg peptid/mL) vs. tid.

Slutpunkts-bestemmelse

  • Initial-hastigheds-metode (foretrukket): Lineær regression af tidlige tidspunkter (0–10% hydrolyse) → V0 (ΔA/min). Undgår slutpunkt-tvetydighed.
  • Plateau-metode: Tidspunkt, hvor ΔA/Δt <5% af initial hastighed (reaktion nær fuldførelse).
  • Fast-tid-assay: Sammenlign A ved defineret tid (f.eks. 10 min) med standard-kurve (casein-hydrolysat).

Fordele over visuel opklaring

  • Kvantitativ, reproducerbar, kinetiske data (Km, Vmax muligt).
  • Ufølsom over for observatør-bias, belysning, partikel-størrelse.
  • Opdager tidlig hydrolyse før synlig opklaring.

Almindelige faldgruber

  • Casein-lot-variabilitet → kør standard-kurve hvert assay.
  • TCA-fældning ufuldstændig → spredning ved 280 nm. Brug 0,22 μm-filter.
  • Trypsin-autolyse ved 37°C → inkluder enzym-kun blank.

Urinsyregigt (gigt)