Molekylær kloning: Protokoller til DNA-sekvensering og replikation

Introduktion

Molekylære kloningsprotokoller omfatter procedurer til at definere, isolere og replikere en DNA-sekvens. Traditionelle restriktions- og ligationsprotokoller initierer DNA-fragmentering med restriktionsendonukleaser (enzym der skærer DNA ved restriktionssteder), DNA-fragmentligation (reparation af diskontinuiteter i DNA-molekyler), transfektion (indførelse af nukleinsyre i cellekroppen) og selektion (udvalg af individuelle gener til replikation).

Isolering

Protokoller til isolering af DNA-fragment (første skridt) inkluderer ofte polymerase-kædereaktion (PCR), der bruger varme/afkølingscykluser til at amplificere DNA-stykker. For at nå målsekvensstørrelse: DNA-soniac, restriktionsenzymfordøjelse, kemisk syntetiserede oligonukleotider. Protokoller varierer efter mængde og størrelse af isoleret DNA.

Ligation

Protokoller til ligation bruger enzymet DNA-ligase til at sammenføje DNA-molekyler med kovalent binding. Protokol: kombiner DNA-fragmenter, kloneringsvektor, ligationsbuffer, DNA-ligase, sterilt vand i mikrocentrifugrør. Inkuber over nat ved 4 °C.

Transfektion

Protokoller til transfektion (DNA ind i celle uden viral vektor) indeholder ofte direkte injektion i celleplasmat. Andre metoder: kemiske reagenser (calciumfosfat, lipider) til at levere transfektionskomplekset gennem cellemembranen. Metoden tester effekten af genmodifikation på specifikke gener.

Selektion (Screening)

Protokoller til selektion bestemmer, hvilke celler der lykkedes med at holde DNA-insertet, og hvilke der skal isoleres. Centrifug henter celler med transfekteret DNA → inkuberet i lysozym-buffer + alkalisk detergent → proteiner/membraner gøres løselige. Acetat fælder proteiner, centrifug + si filtrerer DNA-holdig supernatant. Supernatant fældes med polyetylenglycol, centrifugeres, suspenderes i cesiumchlorid/ethidiumbromid-buffer. Ethidiumbromid farver DNA efter tyngde; med langbølget UV-lys udvindes laveste bånd-DNA med 5 cc sprøjte. Ion-udvekslingssøjle separerer DNA fra ethidiumbromid/cesiumchlorid. Endelige DNA-pellet suspenderes i buffer og detekteres på agarosegelelektroforese.