Molecular Cloning protokoller

molekylær kloning protokoller omfatte de procedurer, der anvendes til at definere , isolere og replikere en DNA-sekvens. Traditionelle restriktions -og ligerings kloning protokoller initiere DNA- fragmentering med begrænsede endonucleaser (enzymer , der skærer DNA-strenge ved restriktionssteder ), DNA-fragment ligering ( reparation af diskontinuiteter i DNA-molekyler ) , transfektion ( indførelse af nukleinsyre i en celle kroppen) og udvælgelse ( det valg af individuelle genomer til replikering ) . Isolation

protokoller til isolering af et DNA-fragment , det første skridt i molekylær kloning , ofte inkorporere en polymerase chain reaction (PMR) , som bruger cykler af opvarmning og afkøling for at forstærke stykker DNA . For at nå målet sekvens størrelse, andre protokoller omfatter DNA lydbehandling reaktion enzym fordøjelse og brug af kemisk fremstillede oligonukleotider. Disse protokoller varierer afhængigt af størrelsen og mængden af ​​isoleret DNA nødvendig.

Ligeringsprodukter

Protokoller for ligatur indebærer anvendelse af et enzym , DNA-ligase , til at slutte sig DNA-molekyler sammen med en covalent binding . Protokol dikterer at kombinere DNA-fragmenter , kloning vektor, en ligatur buffer , DNA ligase og steriliseret vand i et mikrocentrifugerør og inkubere natten over ved 4 grader celsius.
Transfection

protokoller til transfektion, eller infusion af DNA i en celle ved hjælp af en ikke-virale midler , ofte involverer indsprøjtning DNA direkte ind i cellen cytoplasma. Andre metoder omfatter anvendelse af kemiske reagenser, såsom calciumphosphat og lipider, til at levere transfektionen kompleks gennem cellemembranen . Denne metode tester effekten af ​​gen modifikation på funktionen af ​​specifikke gener .
Selection

Selection, eller screening, protokoller bestemme, hvilke celler afholdt med succes DNA insert og angive hvilke celler brug isolation. En centrifuge høst celler, der indeholder det transficerede DNA, som derefter inkuberes i et lysozym ( et naturligt forekommende enzym) buffer og behandlet med et alkalisk rengøringsmiddel , der giver de proteiner og membraner opløselighed. Brug acetat at udfælde proteinerne , en centrifuge og ostelærred foretage DNA -holdige supernatant ( det opløselige væske tilbage fra en centrifugeret forbindelse) . Supernatanten udfældes med polyethylenglycol , centrifugeret og suspenderet i en cæsiumchlorid og ethidiumbromid buffer. Ethidiumbromid farver det DNA ifølge tæthed, og ved anvendelse af en langbølge UV-lys, er det nederste bånd DNA ekstraheret med en fem cc sprøjte. En ligevægt ionbyttersoejlen adskiller DNA fra ethidiumbromid og caesiumchlorid , og den endelige DNA pellet suspenderes i en bufferopløsning og registreret på agarosegelelektroforese.
Hoteltilbud