Hvordan man laver en begrænsning Kort

I de tidlige dage af molekylærbiologi, forskere almindeligt anvendte restriktionsmapping at forstå de gener, de studerer . I moderne forskningslaboratorier er restriktionskortlægning stort set forældet , fordi sekventering er blevet mere bredt tilgængelige og mere økonomisk end tidligere . Men der er tilfælde, hvor en begrænsning kort kan være passende for en forsker til at udføre sine undersøgelser. Den overordnede strategi for restriktionskortlægning indebærer brug af fordøjelsesenzymer til at nedbryde fysisk en DNA-prøve . Når du måler produkter af denne fordøjelse , kan du " samle " brikkerne og udlede den oprindelige sekvens af DNA. Ting du skal
Restriktionsenzymer
Sample DNA
Bufferopløsning Salg Ice og varmt vandbad
Gel elektroforese udstyr
Vis Flere Instruktioner
DNA Fordøjelse

1

Tilføj et restriktionsenzym til din DNA-prøve . Brug EcoR1 , et almindeligt anvendt enzym , for eksempel.
2

Føj denne blanding til en bufferopløsning , som hovedsageligt er et sted for reaktionen at forekomme .
3

Hæv temperaturen af reaktionen som angivet i New England Biolabs manual. Hver restriktionsenzym har en specifik reaktion temperatur, ved hvilken det fungerer bedst. Derudover har hvert enzym har en specifik nukleotidsekvens det er designet til at målrette . EcoRI vil scanne og skære DNA i nukleotidsekvensen CAATTC . Denne nøjagtige rækkefølge af nukleotider må eksistere for enzymet til at binde og klippe DNA. Indtil dette punkt, bør alle materialer holdes på is for at forhindre uønsket aktivitet.
4

Efter lade reaktionen ske som angivet i manualen , skal du køre blandingen i en gelelektroforese maskine til at adskille DNA fragmenter baseret på størrelse . De mindste fragmenter vil bevæge længst over gelen.
5.

Mål distance hver DNA-fragment. Disse fem trin bør gentages med flere forskellige enzymer separat.
Konstruere Restriction Kort
6

Brug af data fra gelen , indsamle alle de oplysninger, du har fundet ved hjælp af forskellige restriktionsenzymer.
7

Udled rækkefølgen af ​​restriktionssteder ved at sammenligne de forskellige fragmentlængder produceret af hvert enzym . For eksempel, hvis enzym # 1 fremstillet to fragmenter af samme længde og enzym # 2 fremstillet tre fragmenter af samme længde , kan man konkludere, at enzymet # 1 snit halvvejs gennem DNA og enzym # 2 skærer DNA'et i tredjedele .

8

Brug af konklusionerne i trin 2 , samle rækkefølgen af ​​restriktionssteder for DNA'et.
hoteltilbud