|  | Sundhed og Sygdom >  | Sygdomme og behandlinger | Genetiske sygdomme

Restriktionskortlægning: Principper, anvendelser og moderne alternativer

Restriktionskortlægning (Restriction Mapping)

I de tidlige dage af molekylærbiologi brugte videnskabsmænd almindeligt restriktionskortlægning til at forstå de gener, de studerede. I moderne forskningslaboratorier er restriktionskortlægning i stor grad forældet, fordi sekvensering er blevet mere bredt tilgængelig og mere økonomisk end i fortiden. Dog findes der tilfælde, hvor et restriktionskort kan være tilstrækkeligt for en forsker til at udføre sine undersøgelser. Den overordnede tilgang til restriktionskortlægning involverer brugen af restriktionsenzym til fysisk at bryde et DNA-prøve ned. Når du måler produkterne af denne fordøjelse, kan du "sammensætte" stykkerne og deducere den oprindelige DNA-sekvens.

Materialer

  • Restriktionsenzym (restriction enzymes)
  • Prøve DNA (Sample DNA)
  • Bufferløsning (Buffer solution)
  • Is og varmt vandbad (Ice and hot water bath)
  • Gel elektroforese udstyr (Gel electrophoresis equipment)

DNA-fordøjelse

  1. Tilføj enzym: Tilføj et restriktionsenzym til din DNA-prøve. Brug EcoR1, et almindeligt brugt enzym, f.eks.
  2. Buffer: Tilføj denne blanding til en bufferløsning, som i princippet er et sted for reaktionen at finde sted.
  3. Incubation: Hæv reaktionens temperatur, som angivet i New England BioLabs manualen. Hvert restriktionsenzym har en specifik reaktionstemperatur, hvor det fungerer bedst. Desuden har hvert enzym en specifik nukleotid-sekvens, det er designet til at målrette. EcoRI vil scanne og skære DNA ved nukleotid-sekvensen GAATTC. Denne præcise rækkefølge af nukleotider skal eksistere for at enzymet kan binde og skære DNA. Indtil dette punkt skal alle materialer holdes på is for at forhindre uønsket aktivitet.
  4. Elektroforese: Efter at have ladt reaktionen foregå, som angivet i manualen, kør blandingen i en gel elektroforese-maskine for at adskille DNA-fragmenterne baseret på størrelse. De mindste fragmenter vil bevæge sig mindst over gellet.
  5. Mål fragmenter: Mål den tilbagelagte afstand for hvert DNA-fragment. Disse fem trin skal gentages med flere forskellige enzymer separat.

Konstruktion af restriktionskort

  1. Samlet data: Brug dataene fra gelet til at samle al information, du har fundet ved brug af de forskellige restriktionsenzym.
  2. Deducer skæresteder: Deducer rækkefølgen af restriktionssteder ved at sammenligne de forskellige fragmentlængder produceret af hvert enzym. For eksempel, hvis enzym #1 producerede to fragmenter af ligelængde, og enzym #2 producerede tre fragmenter af ligelængde, kan du konkludere, at enzym #1 skærer halvvejs igennem DNA'et, og enzym #2 skærer DNA'et i tredjedele.
  3. Saml kortet: Brug konklusionerne fra trin 2 til at samle rækkefølgen af restriktionssteder for DNA'et.

I dag er hele-genom-sekvensering (NGS) standard. Restriktionskortlægning bruges stadig til kloningsvalidering, plasmid-kortlægning og undervisning.

Genetiske sygdomme