Perifer blod mononukleære celler (PBMC): Isolering og kryokonserveringsprotokol

PBMC isolering og kryokonservering

Kryokonserverede perifer blod mononukleære celler (PBMC) er en hyppig kilde til prøver til forskning, der inkluderer immunterapi og reaktioner på vacciner. Mens nogle protokoller er begrænset til isolerings- og indfrysningsfaserne i processen, inkluderer andre optrøjningsprocedurer.

Isolering og indfrysningsprocedure

En kommerciel forbindelse til at fremme separation placeres i hvert 50 mL centrifugerør, og rørene centrifugeres i tredive sekunder. Propperne på blodrørene sprays med alkohol før åbning, derefter overføres antikoagulant-behandlet helblod via pipette til centrifugerørene. Plasmalaget af blodet aspireres med en pipette.

Indfrysning

Cellerne fra det forrige trin vil derefter centrifugeres med bufferet saltvand tre gange. Efter celleoptælling vil prøverne centrifugeres og derefter opspændes i indfrysningsmedium. Prøver i indfrysningsmedium deles derefter mellem kryorør i én mL portioner. Rør opbevares over nat i en -70°C fryser og flyttes til langsigtet opbevaring i flydende kvælstof næste dag.

Sikker optrøjning

Kryorør overføres fra flydende kvælstof til et 37°C vandbad, og prøven tillades at optrøjne i ét til to minutter. Et varmt transportmedium tilføjes til hvert rør. Fordøjet celle-suspension centrifugeres i syv minutter. Antallet og celle-levedygtighed tjekkes. Hvis celler har brug for koncentrering, centrifugeres prøver syv minutter mere. Prøven fordøjes til arbejdsløsning og hviler i tolv til atten timer, før undersøgelsen påbegyndes i det specificerede protokol.

PBMC'er er afgørende for immunologisk forskning. Standardiserede protokoller (f.eks. Ficoll-gradient, kontrolleret frysning med DMSO) sikrer høj cellelevedygtighed post-optrøjning.