Hvilke metoder kan bruges til at studere protein-protein interaktioner?

Adskillige metoder kan bruges til at studere protein-protein-interaktioner. Her er nogle almindeligt anvendte teknikker:

1. Co-immunpræcipitation (Co-IP) :Co-IP er en meget brugt teknik til at studere protein-protein interaktioner. Det involverer immunudfældning af et protein (lokkemadprotein) fra et cellelysat ved hjælp af et antistof, der er specifikt for lokkeproteinet. Det immunpræcipiterede proteinkompleks analyseres derefter for at identificere andre proteiner (bytteproteiner), der interagerer med lokkemadproteinet. Co-IP kan følges af forskellige downstream-analysemetoder, såsom Western blotting, massespektrometri eller immunfluorescensfarvning.

2. Pull-down assays :Pull-down assays er baseret på princippet om affinitetskromatografi. Et lokkemadsprotein immobiliseres på et fast underlag (såsom magnetiske perler eller agaroseharpiks) gennem kovalent binding eller fusion med et mærke (f.eks. GST eller His-tag). Cellelysatet eller den oprensede proteinblanding inkuberes derefter med det immobiliserede lokkemadprotein. Efter vask for at fjerne ubundne proteiner elueres og analyseres de interagerende proteiner (bytteproteiner).

3. Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) :FRET er en teknik, der måler overførslen af ​​energi mellem to tætsiddende fluoroforer (donor og acceptor). Når donor- og acceptorfluoroforerne er tæt på hinanden (typisk inden for 10-100 Å), resulterer excitationen af ​​donorfluoroforen i emission af lys fra acceptorfluoroforen. Denne energioverførsel kan kvantificeres og bruges til at overvåge protein-protein-interaktioner. FRET kan implementeres på forskellige måder, herunder mærkning af proteiner med specifikke fluoroforer eller ved brug af genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og RFP).

4. Biomolekylær interaktionsanalyse (BIA) :BIA, også kendt som overfladeplasmonresonans (SPR), er en etiketfri teknik, der måler ændringer i brydningsindekset ved grænsefladen mellem et objektglas og en flydende væske. Et af de interagerende proteiner immobiliseres på glasoverfladen, og det andet protein føres hen over overfladen. Interaktionen mellem proteinerne fører til ændringer i brydningsindekset, som kan påvises og kvantificeres. BIA kan give information om bindingsaffiniteten og kinetikken af ​​protein-protein-interaktioner.

5. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) :ITC er en teknik, der måler varmeændringen i forbindelse med interaktionen mellem to molekyler. Når proteiner interagerer, frigives varme enten (exotermisk) eller absorberes (endotermisk). ITC kan kvantificere bindingsaffiniteten (Kd) og termodynamiske parametre, såsom entalpiændring (ΔH) og entropiændring (ΔS), af protein-protein-interaktioner.

6. Protein Interaction Arrays :Proteininteraktionsarrays involverer high-throughput-screening af protein-protein-interaktioner i et mikroarray-format. Tusindvis af forskellige proteiner eller peptider immobiliseres på en fast overflade, og bindingen af ​​et specifikt protein af interesse påvises ved hjælp af mærkede antistoffer eller andre detektionsmetoder. Denne teknik giver mulighed for hurtig og storstilet analyse af protein-protein-interaktioner.

7. Gær to-hybrid (Y2H) assay :Y2H-assayet er en genetisk metode, der bruges til at identificere protein-protein-interaktioner i gærceller. Det involverer at fusionere de kodende sekvenser af to proteiner til to forskellige domæner af en transkriptionsfaktor. Hvis de to proteiner interagerer, rekonstitueres transkriptionsfaktoren, hvilket fører til ekspression af et reportergen. Positive interaktioner identificeres baseret på væksten af ​​gærceller på selektive medier eller kolorimetriske assays.

Valget af metode til at studere protein-protein-interaktioner afhænger af de specifikke proteiner af interesse, tilgængeligheden af ​​reagenser og udstyr og det ønskede informationsniveau. Kombinationer af disse teknikker kan også anvendes til at opnå omfattende indsigt i protein-protein-interaktioner.