Protein-protein interaktions metoder: Co-IP, Pull-Down, FRET, SPR, ITC, Arrays og Y2H

Studiet af protein-protein interaktioner (PPIs) kræver komplementære teknikker for at fange forskellige aspekter: binære vs. komplekse interaktioner, affinitet, kinetik og cellulær kontekst. Ingen enkelt metode fortæller hele historien.

1. Co-Immunopræcipitation (Co-IP)

Et antistoffer trækker bait-proteinet ned sammen med interagerende partnere fra cellelysat, bevæger native komplekser. Nedstrøms analyse: Western blot eller masse spektrometri (IP-MS). Begrænsninger inkluderer indirekte interaktioner, antistoftkvalitet afhængighed, og potentiel forstyrrelse af svage/transiente interaktioner under lyse.

2. Pull-Down Assays

Et tagget bait (GST, His, FLAG, Strep) immobiliseres på perler og inkubereres med lysat eller purificeret prey. Vask fjerner ikke-bindere; elution og detektion følger. Egnet til validering af direkte binære interaktioner; udføres in vitro.

3. Fluorescens Resonans Energi Overførsel (FRET)

Donor og acceptor fluoroforer på interagerende proteiner. Energi overførsel (10–100 Å afstand) giver et ratiometrisk signal. Kompatibelt med levende celler (f.eks. CFP/YFP, mTurquoise/mVenus par). Kvantificerer nærhed og dynamik. Kræver mærkning og transfektion.

4. Overflade Plasmon Resonans (SPR / BIAcore)

Mærkefrit. Bait immobiliseret på sensorchip; prey flyder over. Real-time binding kurver giver kinetik (k_on, k_off), affinitet (K_D), og stoiometri. Høy følsomhed; kræver protein purificering.

5. Isotermisk Titrering Kalorimetri (ITC)

Måler varmeændring ved binding. Giver direkte ΔH, ΔS, K_D, og stoiometri (n). Ingen mærkning; løsningsbaseret. Kræver μg–mg mængder protein; lavt throughput.

6. Protein Mikroarrays

Tusinder af proteiner eller peptider plettet på et glas. Sondet med mærket bait til høj throughput screening. Et opdagelsesværktøj; falske positiver/negativer kræver ortogonal validering.

7. Gær To-Hybrid (Y2H)

Genetisk system. Bait (DNA-binding domæne) + prey (aktivering domæne) fusion. Interaktion aktiverer en reporter gen (HIS3, LacZ). Skrener biblioteker in vivo (gær kerne). Geneigt til falske positiver (autoaktivering) og overser post-translationelle modificationer.

Valg af metode

Mål	Anbefalet metode(r)
Endogen kompleks identifikation	Co-IP + MS
Direkte binær validering	Pull-down, SPR, ITC
Levende celle dynamik	FRET/BRET
Høj throughput screening	Y2H, protein arrays
Termodynamik	ITC
Kinetik	SPR

Ortogonal validering (to eller flere metoder) er standarden for høj-tillid PPIs.