NADPH-oxidase assays: Metoder og anvendelser

Enzymet NADPH-oxidase identificeres som en producent af reaktive iltspecier under processer, herunder vækst af vaskulære glatte muskelceller. Disse reaktive specier er forbundet med en række sygdomme, herunder hypertoni, diabetes, kræft og inflammation; metoder til overvågning af denne enzymes aktivitet er kritiske for mulig behandlingsudvikling.

NADPH-oxidase

NADPH-oxidase tilhører en familie af enzymer, der assisterer med elektronoverførsel mellem NADPH og ilt. Dog har NADPH-oxidase den unikke evne til at producere reaktive iltspecier fra denne reaktion, i modsætning til andre familiemedlemmer, hvor reaktive iltspecier genereres via andre midler. Et multimerisk proteinkompleks, NADPH-oxidase består af det membranbundne flavocytochrom b558, som bruges som et måle-mærker.

Generering af reaktive iltspecier (ROS)

Som den primære kilde til ROS, især hydrogenperoxid, producerer NADPH-oxidase små, men konsistente mængder via sin isoform udtrykt i blodkar, som er involveret i signaleringsprocesser. Denne konsistente produktion kan til sidst overvælde det naturlige antioxidativsystem, hvilket forårsager et tab af beskyttende stoffer som nitrogenmonoxid, og generering af endnu mere kraftfulde ROS.

Kemiluminescens-metode

Kemiluminescens muliggør en meget følsom, automatiseret måling af NADPH-oxidase aktivitet over et udsnit af koncentrationer. Under denne metode tilføjes NADPH-substrat til et vævsprøve, der indeholder NADPH-oxidase. Ved reaktion genereres ROS og reagerer med stoffet lucigenin for at producere en kemiluminescent effekt, som måles. Luminescens er direkte proportional med NADPH-oxidase aktivitet, da enzyme bestemmer reaktionshastigheden.

Kinetisk assay via flowcytometri

I denne metode analyseres vævsprøver via flowcytometri. Benmarg adskilles fra prøven ved hjælp af Hanks' Balanced Salt Solution. Specifikke farvestoffer og detekterende antistoffer tilføjes prøven i polystyrenrør. Prøven inkuberes derefter, vaskes med Hanks' Balanced Salt Solution, mærkes med molekylære sondber og forberedes til flowcytometri. Kontrolrør laves også til sammenligning og til at kalibrere flowcytometeret. Maskinen køres derefter, og målinger registreres.