Celle-lyse: Omfattende Protokol til Protein-isolering

Introduktion

Små proteiner kan fremstilles syntetisk, men af mange årsager findes der ingen syntetisk maskineri, der er bedre end cellen selv. Typisk er det første skridt i protein-isolering celle-lyse.

Celle-lyse

Ordet "lyse" kommer fra en græsk rod, der betyder "at løse op". Ved celle-lyse forstyrres de kræfter, der holder cellemembranen sammen, hvilket forårsager, at den revner. Cellenes indhold frigives derefter i den omgivende løsning, herunder det protein, der interesserer. Dette sker normalt ved tilføjelse af en kemisk løsning, kaldet lyse-buffer.

Fremstilling af Lyse-buffer

En myriade af forskellige lyse-løsninger er tilgængelige kommercielt, eller almindelige opskrifter kan bruges til at fremstille lyse-buffer fra almindelige kemikalier. Den bedste buffer at bruge vil variere afhængigt af celle-typen, proteinet, der skal isoleres, og den endelige anvendelse, men generelt indeholder en lyse-løsning et detergent-molekyl (ofte NP-40 eller Triton-X), der opløser cellemembranen, sammen med buffere, chelatorer og protease-hæmmere for at forhindre, at proteinet skades, når det er frigivet fra cellens beskyttende miljø.

Lyse-betingelser

Lyse-buffer bruges normalt is-kold, og lyse-processen tillades at foregå under kolde betingelser. Løsningen ristes let for at opmuntre jevn fordeling af celler og lyse-produkter. Efter ca. 5 til 10 minutter neutraliseres lyse-løsningen normalt for at forhindre yderligere aktivitet. Disse forebyggelsesforanstaltninger reducerer skader på proteinet og reducerer mængden af overflødigt affald, der senere skal fjernes.

Andre Lyse-metoder

Selvom kemisk lyse er den mest blide og mest almindeligt brugte, kan hårdere mekaniske metoder til at lyse celler bruges i nogle tilfælde. Disse inkluderer sonikation, gentagne fryse-opfyldnings-cyklusser og homogenisering, som er en malsnings-proces. Konsulter den tekniske litteratur for at finde den mest passende metode til dit specifikke tilfælde.