Flow cytometry metoder: En omfattende guide til celleanalyse

Princippet bag flow cytometry

Flow cytometry bygger på hydrodynamisk fokusering ved hjælp af en lysudsendelseskilde (laser) til at måle og analysere fysiske egenskaber ved enkelte partikler. Metoden anvendes primært til celleanalyse, herunder celle størrelse, granulæritet og fluorescensintensitet. Vigtige detektionsmetoder: forspredt lys (forward-scatter), sidespredt lys (side-scatter) og fluorescens.

Flow cytometer

• Et flow cytometer består af fluidik, optik og elektronik. Fluidiksystemet transporterer prøvestrømmen til laserstrålen. Optiksystemet indeholder lasere og optiske filtre, der belyser prøver og retter lyssignaler til detektorer. Detekteret lys omdannes til elektroniske signaler af elektroniksystemet til computeranalyse.

Forspredt lys (Forward-Scattered Light)

• Difffraheret lys spredt i fremad retning detekteres ca. 20 grader fra laseraksen af en fotodiod (FSC-kanal). FSC er proportional med partikkeloverfladeareal og bruges som indikator på celle størrelse samt til at skelne levende og dode celler. Anvendes i immunofenotypning som udløser for signalbehandling.

Sidespredt lys (Side-Scattered Light)

• Sidespredt lys refererer til lys, der brydes ved cellulære grænseflader, målt ca. 90 grader fra laseraksen af side-spredningskanalen (SSC), omdirigeret til detektor via strålesplitter. SSC svarer til cellegranulæritet eller indre kompleksitet og bruges til at bestemme granulært indhold. Kombineret med FSC skelner det mellem celletyper.

Fluorescens

• Fluorescens giver kvantitative og kvalitative oplysninger om intracellulære molekyler (cytokiner, DNA) og celleoverfladereceptorer ved brug af fluorokrommærkater og måling ved forskellige bølgelængder. Hvert fluorokrom har et specifikt absorptionsspektrum. Fluorescens opstår, når et eksiteret elektron udsender et foton efter lysabsorption.