Protease-substrat-mærkning: Bedste praksis til produktidentifikation

Proteiner og proteaser

Proteiner er en komponent i hver celle i kroppen. Proteaser (også henviset til som proteolytiske enzymer eller proteinaser) er fordøjelsesenzymers, hvis funktion er at bryde proteiner ned. Udover fordøjelse er proteaser også essentielle for blodkoagulation, metabolsk kontrol og immunregulering. Under den biokemiske proces (katalyse) binder substrater til enzymets aktive sted og omdannes til ét eller flere produkter, der derefter frigives fra stedet. Denne proces kan forstærkes eller hæmmes for at øge eller reducere reaktioner i kroppen, afhængigt af det ønskede resultat. Mærkning af substratprodukter tillader videnskabsmænd at måle denne enzymatiske aktivitet. Fluorescensmærkning er en teknik, der bruges til at farve bestemte molekyler, hvilket gør dem nemmere at spore.

Udstyr du har brug for

• Målmolekyl-cocktail
• Fluorescensfarve-mærkningssæt
• Fluorescensmåleinstrument

Instruktioner: Sådan mærkes protease-substratprodukter

1. Vælg din fluorescensfarve: Almindelige farver inkluderer rhodamin og fluorescein. Disse kan normalt købes fra producenter.
2. Kør reactionen og fjern ubrugt fluorofor: Fra målmolekyler ved brug af størrelses-eksklusionskromatografi (en proces, der adskiller molekyler baseret på deres størrelse). Farvefjernelseskolonner bruges også almindeligt. Disse annoncere ofte sammen med mærkningssæt.
3. Detekter molekylerne: Brug et fluorescensmåleinstrument, såsom et fluorescensmikroskop. Lys af en specifik bølgelængde sendes gennem molekylet (indirekte for nogle teknikker), hvilket belyser fluoroforen.
4. Tag dine målinger: Fordi assays måler enten, hvor meget substrat der er forbrugt, eller mængden af produkt frigivet over en tidsperiode, kan enzymmængder måles i mol (fysisk størrelse) eller i enhedsområder (aktivitet).