Rensning af Tissue Plasminogen Activator (TPA): Protokoller og anvendelser

Tissue plasminogen activator (TPA) er en type serineprotease, et protein, der kan nedbryde blodpropper. TPA findes i cellerne, der internt dækker blodkärlene. TPA-protokoller er en del af farmaceutisk og medicinsk forskning på apopleksi samt hjerte- og lungesygdomme, såsom lungeemboli og hjerteinfarkt. TPA-rensning henviser til isolering af dette protein fra andre molekyler gennem en række processer, herunder kromatografi og elektroforese.

Rensning af TPA fra grisenyre

Denne protokol bruges i studier af fibrinolysen, processen med at bryde fibrin, koagulationens produkt, relateret til tumordannelse. Teknikere ekstraherer TPA fra acetontørret grisenyre med kaliumacetatbuffer ved pH 4,2. Derefter tilføjes ammoniumsulfat for at indføre cellefald. Der tilføjes n-butyl-sepharose til prøverne, som derefter analyseres på en kromatograf. Concanavalin A tilføjes også, og kromatografi udføres for at adskille forskellige proteiner.

Rensning af TPA fra kinesisk hamsterøjeceller og E. coli-celler

Proteinværdighed er en vigtig faktor for succes i biologiske eksperimenter. Renset TPA er også kommercielt tilgængelig, hvilket sparer tid og undgår risikoen for at sætte eksperimentet i fare på grund af dårligt renset løsning. Denne protokol involverer rensningsprocesser af TPA i pattedyr- og bakterieceller. Teknikere fælder celleprøver, filtrerer dem og udfører affinitets- og gelkromatografianalyse. Senere analyseres og sammenlignes resultaterne før kommercial produktion.

Udtryk af aktivt human TPA i E. coli

Klarificerede celllysater tilføjes en lysin-sepharose-søjle, analyseres i en kromatograf og vaskes med en natriumklorid-løsning. En anden prøve lastes på en anden kromatografisøjle, der indeholder proteiner, der binder til TPA med meget høj affinitet. En prøve fra den anden søjle blandes med en zink-sepharose-løsning. Det resulterende protein viser mere end 90 % renhed, ifølge tidsskriftet "Applied and Environmental Microbiology".