QuikChange Mutagenese-kits: Protokoller og anvendelser | Agilent

Hvad er QuikChange?

QuikChange-mutagenese er varemærkenavnet på et kit, der bruges i bioteknologisk forskning til at indføre genetiske mutationer eller DNA-forandringer. Agilent Technologies er firmaet bag produktet, som findes i to versioner: QuikChange II og QuikChange Lightning. Begge kits indeholder en bufferløsning, enzymet DNA-polymerase, farvereagenter, DNA-sekvenser eller primere, og celleprøver.

Mutant Strand Synthesis Reaction Protocol

Teknikere syntetiserer to oligonukleotider eller korte DNA-sekvenser, der indeholder den ønskede mutation. Derefter forbereder de kontrol-reaktionen med DNA-sekvenser, dNTP-blanding og DNA-polymerase-enzym, og tilføjer destilleret vand. Senere forbereder de en række prøve-reaktioner ved at bruge forskellige koncentrationer af dobbeltstrenget DNA (dsDNA), mens primere/oligonukleotid-koncentrationen holdes konstant, ifølge producentens instruktioner. De holder prøverne ved 203°F (ca. 95°C) i 30 sekunder. Prøven med DNA-segment nummer to testees også under temperatur-cykling, en teknik, hvor temperaturen skifter i korte tidsintervaller. Til sidst placeres prøverne på is i to minutter.

Dpn I Fordøjelse af Amplifikationsprodukter Protocol

Dpn I-restriktionsenzym skærer DNA'et på specifikke steder. Et mikroliter af dette enzym tilføjes direkte til hver amplifikationsreaktion under dens standardige mineralolie-overlag ved brug af en mikropipette eller specialiseret aerosol-modstandende pipette-tip. Dog er mineralolie-overlag kun nødvendigt, hvis den termiske cyklér, et apparat der bruges til at amplificere DNA-segmenter, ikke har en hot-top samling. Reaktionen røres forsigtigt og sættes senere i en mikrofuge i ét minut. Derefter inkuberes prøverne ved 98,6°F (37°C) i en time.

Transformation af XL1-Blue Superkompetente Celler Protocol

XL1-Blue er en tetracyklin-modstandsdygtig cellelinje, der følger med QuikChange Mutagenese-kits. Under denne protokol tiner teknikere cellerne, som tidligere holdt ved -112°F (-80°C), på is. Derefter tilføjer de et mikroliter af Dpn I-behandlet DNA, opvarmer det til 107,6°F (ca. 42°C) i 45 sekunder og placerer reaktionen på is i to minutter. Efter denne procedure tilføjer teknikere en præparation af NZY (kasein-hydrolysat og gist-ekstrakt) forvarmet til 107,6°F og inkuberer i en time. Præparationen sættes derefter på agar-gel-plader og inkuberes ved 98,6°F i 16 timer.