| | Sundhed | sygdom |

molekylær kloning protokoller

　　 Molekylær kloning protokoller omfatter de procedurer, der anvendes til at definere , isolere og kopiere en DNA- sekvens . Traditionelle begrænsning og ligatur kloning protokoller indlede DNA fragmentering med begrænset endonucleases ( enzymer , der skærer DNA-strenge på begrænsning steder ) , DNA-fragment ligatur ( reparation af afbrydelser i DNA -molekyler ) , transfektion (indførelse af nukleinsyre i en celle kroppen ) og udvælgelse ( den vælge de enkelte genomer til replikering ) .

Isolation

protokoller til isolering af en DNA- fragment , det første skridt i molekylær kloning , ofte forbundet med en polymerase chain reaction ( PMR ) , der benytter cykler for opvarmning og afkøling til at forstærke stykker af DNA . For at nå målet sekvensen størrelse, protokoller bl. a. dna sonikering , reaktion enzym fordøjelsen og brug af kemisk fremstillede oligonukleotider . Disse protokoller varierer afhængigt af størrelsen og mængden af isolerede DNA behov .

ligatur

Protokoller for ligatur indebærer brug af en enzym , DNA ligase , at slutte sig DNA- molekyler sammen med en kovalent binding . Protokollen dikterer kombinere DNA-fragmenter , kloning vektor , en ligatur buffer , DNA ligase og steriliseret vand i en mikrocentrifugerør og inkubere natten over ved 4 grader Celsius .

Transfektering

Protokoller for transfektering , eller infusion DNA i en celle ved hjælp af en ikke-viral betyder , ofte involverer indsprøjtning DNA direkte ind i cellen cytoplasma . Andre metoder omfatter brug af kemiske reagenser , såsom calcium fosfat og lipider , til at levere den transfektering komplekse gennem cellemembranen . Denne metode tester effekten af genetiske modifikation om, hvordan specifikke gener .

Selection

Valg , eller screening , protokoller afgøre , hvilke celler afholdt med succes DNA indsætte og angive, hvilke celler har brug for isolation . En centrifuge høst celler, der indeholder transfekterede DNA , som derefter inkuberes i en lysozym ( en naturligt forekommende enzym ) buffer og behandlet med en alkalisk rengøringsmiddel , der giver de proteiner og membraner opløselighed . Brug acetat til fældning af proteiner , en centrifuge og ostelærred filtrere DNA -holdige supernatant (de opløselige flydende resterende fra en centrifugeres stof) . Supernatanten fældes med polyethylen centrifugeres glycol , og ophængt i en caesiumchlorid og ethidiumbromid buffer . Den ethidiumbromid pletter DNA i henhold til tæthed , og ved hjælp af en lang-bølge UV-lys er den nedre -band DNA ekstraheres med en fem cc sprøjte . En ligevægt ionbyttersoejlen adskiller DNA fra ethidiumbromid og caesiumchlorid , og den endelige DNA pellet er ophængt i en bufferopløsning og registreret på agarosegel elektroforese .

Relaterede Sundhed Artikler