Tuberkulose Gram-farvning: En omfattende guide

Hvad er tuberkulose?

Tuberkulose er en smitsom sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberculosis. Det er en respiratorisk sygdom, der karakteriseres ved dannelse af tuberkler, necrose, abcesser, fibrose og kalkning i lungerne. Den kan også inficere nyrer, lymfeknoggler, knogler, led og hud.

Primær laboratoriediagnostik af Mycobacterium tuberculosis indeholder farvning for at visualisere bakterierne under mikrokopet. Det foretrukne prøvemateriale er sputum eller bronkoalveolært lavage for at identificere en respiratorisk infektion eller et vævsprøve.

Fysiologi

Mycobacterium tuberculosis er en stangformet (bacilli), ikke-motil, ikke-sporedannende, obligat aerob bakterie. De måler 0,4x3 mikrometer i længden. Mycobacterium tuberculosis gennemgår binær fissiparitet (reproduktiv celledivision) hvert 15. til 24. time, hvilket er langsomt sammenlignet med andre bakterier. På grund af dette kan mycobacterium tage op til ni uger at fremvise sig på kulturmedier.

Mycobacterium tuberculosis er følsom overfor UV-lys og varme (f.eks. pasteurisering), men modstandsdygtig overfor kemiske desinfektionsmidler.

Gram-farvning

Mycobacterium tuberculosis kan ikke rigtigt klassificeres som gram-positiv eller gram-negativ. Gram-klassifikationen bygger på mængden af peptidoglykan i en bakteries cellevæg. En gram-positiv bakterie har et tykt peptidoglykanlag (ca. 90 procent), mens en gram-negativ bakterie har et tyndt peptidoglykanlag (5-20 procent). Gram-farverne penetrerer cellevæggen og binder til de kemiske komponenter i cellevæggen. De farvede bakterier vil fremstå lilla eller rosa under mikrokopet.

Ved Mycobacterium tuberculosis er cellevæggen sammensat af peptidoglykan, men også komplekse lipider, som hæmmer gram-farvningens penetration. Cellevæggen modstår også decolorisering ved syre eller alkohol, så mycobacterierne kaldes "surefaste". Cellevæglipiderne er mykolsyre, snor-faktor og voks-D. Hvis bakterierne skulle farves, ville de bakterielle celler fremstå svagt gram-positive eller blege med meget lidt farve.

For at visualisere bakterierne skal specielle farvninger som Aumarine-farvningen eller Ziehl-Neelsen-farvningen udføres.

Auramin-rhodamin-farvning

Auramin-rhodamin-processen bruger et gult fluorescerende farvestof til at visualisere Mycobacterium tuberculosis under et fluorescensmikroskop. Kaliumpermanganat eller acridinorange kan bruges som modfarvning. Under objektivet vil de bakterielle celler fremstå grønne.

Auramin-rhodamin-farvningen er mere følsom end Ziehl-Neelsen og mere omkostningseffektiv.

Ziehl-Neelsen-farvning

Ziehl-Neelsen-farvningen stammer fra videnskabsmændene Franz Ziehl og Friedrich Neelsen. Den bruger ophedet karbolfuchsin, højkonsentreret syre-alkohol og en modfarvning som malachitgrøn eller methylenblåt. Under et fluorescensmikroskop vil de bakterielle celler fremstå lyserøde.

Ziehl-Neelsen er guldstandarden for primæridentifikation af Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae.

Agar

Sekundært til mikroskopisk identifikation skal Mycobacterium tuberculosis dyrkes på specielt kulturagar. Lowenstein-Jensen-agar indeholder komplekse organiske stoffer (f.eks. æg, kartoffel), salte, glycerin og malachitgrøn (hæmmer andre bakterier). Antibiotika kan tilføjes for yderligere at hæmme forurenende bakterier. Prøven placeres på denne agar, og bakterierne vokser i tre til ni uger.

En kulturøvelse af næringsstoffer som albumin og biotin kan bruges til at understøtte væksten af endda den mindste mængde af målbakterierne. Dette kaldes Middlebrook 7H9 (eller 7H12) medium.

Kolonierne vil fremstå som små, polerede, lysebrune kolonier på begge medier.

Med avanceret teknologi kan Mycobacterium tuberculosis nu dyrkes ved hjælp af en automatisk aflæser. En flydende løsning af Middlebrook 7H9-medium og en fluorescerende indikatorstof bruges til at overvåge væksten og rapportere positiv eller negativ infektion.