Hoechst-farvningsprotokoller: DNA & RNA-mærkning til mikroskopi & flowcytometri

Hoechst-farvninger er fluorescerende farvestoffer, der bruges til mærkning af DNA og RNA gennem fluorescensmikroskopi- og flowcytometri-teknikker. Hoechst 33258 og Hoechst 33342 er de mest anvendte af disse farvestoffer. De har evnen til at binde til DNA-molekyler, hvilket får kerner og mitokondrier til at fremstå fluorescerende under ultraviolett lys. Protokoller for Hoechst-farvning er almindelig praksis i bioteknologiske og genetiske laboratorier, og omfatter cellefarvningsteknikker ved brug af både Hoechst 33258 og Hoechst 33342.

Hoechst 33342 HSC-farvning og stamcelle-rening protokol

Denne protokol bruges til at farve celler fra musers benmarg. Teknikere forbereder benmargprøve med HBSS+ saltopløsning, HEPES-buffer og fætal kalvserum. De centrifugerer løsningen og tilføjer en forvarmet DMEM-medium. Hoechst-farvstof tilføjes derefter. Løsningen placeres i et 37°C (98,6°F) vandbad i præcis 90 minutter, ifølge Department of Immunology ved University of Pittsburgh. DNA-segmenter fremstår fluorescerende under en cytometer.

Hoechst 33342 DNA-farvning

Under denne protokol løfter teknikere Hoechst 33342-farvstof i destilleret vand, tilføjer 2 % fætal kalvserum til celleprøven, holder pH på 7,2 med hjælp en bufferløsning. Celler inkuberes derefter ved 37°C i en time, og analyseres straks med et udstyr kaldet cytometer.

Farvet DNA er derefter synligt og fluorescerende, ifølge University of Michigan Health System.

DNA-detektion ved brug af DNA-bindende fluorokrom Hoechst 33258

Denne protokol bruger et stykke udstyr kaldet spektrofotometer til at analysere DNA- og RNA-segmenter. Teknikere bruger Hoechst 33258 arbejdsløsning og kalvthymus DNA-prøver. De laver også en separat løsning ved brug af DNA-prøven og et kemisk stof kaldet etidiumbromid. Senere sammenligner de cellefarvningsresultater i begge medier ved brug af et spektrofotometer, ifølge Current Protocols in Cytometry.