Kryopræservering Procedurer

Kryopræservering procedurer er dem, der tillader celler, der skal opbevares på ubestemt tid ved hjælp af ekstremt kolde temperaturer for at suspendere metaboliske aktiviteter . Der er to hovedtyper af kryopræservering procedurer: Equilibrium ( konventionel langsom nedfrysning ) og ikke- ligevægt eller ultra- hurtig nedfrysning ( forglasning ) . Udtrykket vitrificering kommer fra det latinske " glasagtig " eller glasagtig . Begge procedurer bruger kryobeskyttelsesmidler med frostvæske - type egenskaber for at forhindre cellulære skader under indfrysningen . Når cellerne er frosne eller forglasset , kan de opbevares på ubestemt tid ved at nedsænke dem i flydende nitrogen , en ekstremt kold væske med en temperatur på -196 C ( -321 F). For at genoprette metaboliske aktivitet i cellen ved optøning skal giftige kryobeskyttelsesmidler fjernes fra cellen , og den normale vandbalance gradvist genoprettet som cellen er vendt tilbage til en normalt fungerende temperatur . Oversigt

Oversigt

Kryopræservering procedurer er dem, der tillader celler, der skal opbevares på ubestemt tid ved hjælp af ekstremt kolde temperaturer for at suspendere metaboliske aktiviteter . Der er to hovedtyper af kryopræservering procedurer: Equilibrium ( konventionel langsom nedfrysning ) og ikke- ligevægt eller ultra- hurtig nedfrysning ( forglasning ) . Udtrykket vitrificering kommer fra det latinske " glasagtig " eller glasagtig . Begge procedurer bruger kryobeskyttelsesmidler med frostvæske - type egenskaber for at forhindre cellulære skader under indfrysningen . Når cellerne er frosne eller forglasset , kan de opbevares på ubestemt tid ved at nedsænke dem i flydende nitrogen , en ekstremt kold væske med en temperatur på -196 C ( -321 F). For at genoprette metaboliske aktivitet i cellen ved optøning skal giftige kryobeskyttelsesmidler fjernes fra cellen , og den normale vandbalance gradvist genoprettet som cellen er vendt tilbage til en normalt fungerende temperatur .
Celle- specifikke faktorer

bruges til Cryopreservering celler eller væv procedure afhænger af en række faktorer, herunder størrelsen af cellen , mængden af ​​væske ( cytoplasma ) og kompleksiteten af cellen ( enkelt celle eller væv) . Celler med en stor mængde cytoplasma såsom æg er sværere at kryopræservere end celler med kun resterende cytoplasma , som sædceller. Kryopræservering af ovarievæv er mere udfordrende, fordi mindst tre forskellige celletyper af varierende størrelser er til stede i ovarievæv , hver med forskellige optimale frysning behov. Slow- indefrysning protokoller har været anvendt med succes med forskellige typer af celler. Vitrifikation øjeblikket er mest effektiv med encellede frysning og mindre effektiv med væv , men forskning er i gang for at optimere forglasning af væv.
Rolle

cytoplasma af Kryobeskyttelsesmidler hoteltilbud en celle indeholder vand, som bliver til iskrystaller ved frysepunktet . Hvornår dannes is inde i en celle, cellen makuleret og dør. Derfor væsken i cellen har brug for at blive fjernet , før det når frostgrader at undgå skader celle. Forskellige typer af frostvæske ( kryobeskyttende ) væsker kan anvendes til at dehydrere den celle, før frysning, herunder glycerol, propandiol dimethyl sulfoxde (DMSO) , ethanol og sukkerarter som saccharose og trehalose . Den optimale hastighed for afkøling ( og optøning ) afhænger af typen af ​​kryobeskyttelsesmiddel anvendt, og på karakteristisk for den celle eller væv til at være (eller var) frosset. Kryobeskyttelsesmidler er giftige for metaboliske celler, så celle eksponeringer for kryobeskyttelsesmidler ved varmere metaboliske temperaturer skal minimeres eller undgås. Ved optøning eller opvarmning af celler, skal kryobeskyttelsesmidler fjernes helt fra cellen før metaboliske aktivitet er genoprettet.
Equilibrium Versus Non- Equilibrium Kryopræservering Procedure

Satsen for frost afhænger af, om protokollen frysning er ligevægt eller ikke- equilbrium -baseret. For ligevægt typen procedurer, er optimale frysning sats opnås, når der er en balance mellem den hastighed, hvormed cellen bliver dehydreret af vand og den hastighed, hvormed vand uden for cellen er ved at blive forvandlet til isen scenen. Disse ligevægt eller langsomt fryse protokoller normalt tage timer at gennemføre , og en computer bruges til at køre en programmerbar hastighed fryser at sikre, at fryse satser er nøjagtigt som det kræves. Der er typisk en " hold" træde i protokollen nær starten at lade den manuelle oprettelse af starterkulturer iskrystaller eller " seeding " i væsken uden for cellerne .

forglasning , anvendes en helt anden tilgang til frysning , der ikke er afhængige af ramper og opnå en ligevægt mellem dehydrering og iskrystaldannelse . Vitrifikation er så ultra- hurtig , at der er tilstrækkelig tid til isdannelse og væske omdannes direkte til en glasagtig eller glas fase , uden at beskadige cellen. Programmerbare sats frysere er ikke påkrævet , da cellen er direkte kastet ud i ekstremt koldt flydende nitrogen , opnå en øjeblikkelig glasagtig tilstand .
Slow- Freeze Procedure

Det første skridt i den langsomme fryse procedure er at eksponere cellen til kryobeskyttelsesmiddel i en gradvis trinvis langsomt tillade ækvilibrering af cellen med kryobeskyttelsesmiddel under frigivelse vand. Når cellerne er blevet renset for de fleste af cellulær vand cellerne i kryobeskyttelsesmidlet væske anbringes i en beholder af en slags, såsom et sugerør , en glasampul eller en plastik vial.The volumen væske , der omgiver celler til langsom frysning er typisk mindre end en teskefuld og må kun være et par dråber . Den præ -mærkede beholderen er fyldt , forseglet og sat i en programmerbar fryser, der langsomt aftager temperaturen af beholderen over et tidsrum på minutter eller timer til meget lave temperaturer . Efter et par minutters afkøling , skal starteren iskrystaller dannes inde i beholderen med " seeding " beholderen. Podning udføres ved hjælp af et værktøj (fx en pincet ), der er blevet præ - afkølet i flydende nitrogen til at røre beholderen og forårsage dannelse af iskrystaller . Denne forret krystal vil igangsætte kontrolleret iskrystaldannelse på ét sted , sikkert væk fra cellerne. Når såning er færdig, kan resten af ​​køling ramper fortsætte. Når beholderen når temperaturer mellem -30 og -85 C , kan beholderen holder cellerne blive kastet direkte ind i flydende nitrogen for at fuldføre afkøling til -196 C.
Forglasning

Ultra hurtige ikke-ligevægts nedkøling procedurer såsom vitrificering bruge højere koncentrationer af kryobeskyttelsesmidler kombineret med en næsten øjeblikkelig indefrysning , der opnås ved at kaste celler direkte i flydende nitrogen . Forglasning omgår is- krystaldannelse fase og bevæger vand direkte ind i en glasagtig fase. Vitrifikation opnår samme endpoint som langsom frysning, men med en hastighed på -3000C/min sammenlignet med 10C/min eller mere. For vitrificering cellerne normalt placeret på spidsen af ​​et strå og overskydende kryobeskyttelsesmiddel er fjernet , så kun nok til, at cellen klynger sig til beholderen ved overfladespænding, før den falder i flydende nitrogen . Fordi frysning er så hurtig, varigheden af eksponeringen for kryobeskyttelsesmidler er meget mindre og meget højere koncentrationer af kryobeskyttelsesmidler kan tolereres af cellen. Opvarmning af cellen til at returnere det til normal metaboliske funktion skal også være utrolig hurtig . Håndtering af forglasset prøver er meget mere krævende end slow- frosne prøver , fordi selv en kortvarig udsættelse for en temperatur over det flydende kvælstof kan starte en uplanlagt opvarmning proces og genindfrysning , hvilket er skadeligt for cellen.