Kryopreservation: Metoder og teknikker til langsigtet celleopbevaring

Kryopreservationsprocedurer er dem, der tillader celler at blive opbevaret uendeligt ved at bruge ekstremt kolde temperaturer til at suspendere metaboliske aktiviteter. Der findes to hovedtyper kryopreservationsprocedurer: equilibrium (konventionel langsom fryse) og non-equilibrium eller ultra-rapid fryse (vitrifikation). Termen vitrifikation kommer fra det latinske "vitreous" eller glasagtig. Begge procedurer bruger kryoprotektanter med antifrost-egenskaber for at forhindre cellulær skade under fryseprocessen. Når celler er frosset eller vitrifieret, kan de opbevares uendeligt ved at sætte dem ned i flydende kvælstof, en ekstremt kolde væske med en temperatur på -196 C (-321 F). For at gendanne metabolisk aktivitet i cellen ved optining, skal giftige kryoprotektanter fjernes fra cellen, og den normale vandbalance gradvist gendannes, mens cellen returneres til en normal funktions-temperatur.

Overblik

Kryopreservationsprocedurer er dem, der tillader celler at blive opbevaret uendeligt ved at bruge ekstremt kolde temperaturer til at suspendere metaboliske aktiviteter. Der findes to hovedtyper kryopreservationsprocedurer: equilibrium (konventionel langsom fryse) og non-equilibrium eller ultra-rapid fryse (vitrifikation). Termen vitrifikation kommer fra det latinske "vitreous" eller glasagtig. Begge procedurer bruger kryoprotektanter med antifrost-egenskaber for at forhindre cellulær skade under fryseprocessen. Når celler er frosset eller vitrifieret, kan de opbevares uendeligt ved at sætte dem ned i flydende kvælstof, en ekstremt kolde væske med en temperatur på -196 C (-321 F). For at gendanne metabolisk aktivitet i cellen ved optining, skal giftige kryoprotektanter fjernes fra cellen, og den normale vandbalance gradvist gendannes, mens cellen returneres til en normal funktions-temperatur.

Celle-specifikke faktorer

Proceduren, der bruges til at kryopreservere celler eller væv, afhænger af en række faktorer, herunder cellens størrelse, mængden af cellulær væske (cytoplasma) og cellens kompleksitet (enkeltcelle eller væv). Celler med en stor mængde cytoplasmer, såsom æg, er sværere at kryopreservere end celler med kun restcytoplasma, som sædceller. Kryopreservation af ovarievæv er mere udfordrende, fordi mindst tre forskellige celletyper af varierende størrelser er til stede i ovarievævet, hver med forskellige optimale frysebehov. Langsom-fryse-protokoller har været brugt med succes med forskellige celletyper. Vitrifikation er i øjeblikket mest effektiv med enkeltcelle-fryse og mindre effektiv med væv, men forskning løber for at optimere vitrifikation af væv.

Kryoprotektrans rolle

Cytoplasmaet i en celle indeholder vand, som omdannes til iskrystaller ved frysetemperatur. Når is danner sig inde i en celle, revnes cellen og dør. Derfor skal væsken i cellen fjernes før nåden af frysetemperaturer for at undgå celskade. Forskellige typer antifrost (kryoprotektant) væsker kan bruges til at dehydrere cellen før fryse, herunder glyserol, propandiol, dimethylsulfoxid (DMSO), ethanol og sukker som sukrose og trehalose. Den optimale afkylningshastighed (og optining) afhænger af den type kryoprotektant, der bruges, og af cellens eller vævets karakteristika, der skal (eller der var) frosset. Kryoprotektanter er giftige for metaboliserende celler, så celle-eksponering for kryoprotektanter ved varmere metaboliske temperaturer skal minimeres eller undgås. Ved optining eller opvarmning af cellerne skal kryoprotektanter fjernes fuldstændigt fra cellen, før metabolisk aktivitet gendannes.

Equilibrium vs. Non-Equilibrium Kryopreservationsprocedure

Frysehastigheden afhænger af, om fryseprotokollen er equilibrium- eller non-equilibrium-baseret. For equilibrium-type procedurer opnås den optimale frysehastighed, når der er en balance mellem den hastighed, hvormed cellen dehydreres for vand, og den hastighed, hvormed vand uden for cellen omdannes til is-fasen. Disse equilibrium eller langsom-fryse-protokoller tager normalt timer at gennemføre, og en computer bruges til at køre en programmerbar rate-fryseapparat for at sikre, at frysehastighederne er præcis som krævet. Der er typisk et "hold"-trin i protokollen tæt på start for at tillade manuel oprettelse af starter iskrystaller eller "seeding" i væsken uden for cellerne.

I vitrifikation bruges en helt anderledes tilgang til fryse, der ikke bygger på ramper og at opnå en balance mellem dehydrering og iskrystaldannelse. Vitrifikation er så ultra-rapid, at der ikke er tilstrækkelig tid til isdannelse, og den cellulære væske omdannes direkte til en vitreous eller glas-fase, uden skade på cellen. Programmerbare rate-fryseapparater er ikke nødvendige, fordi cellen direkte dykkes ned i ekstremt kold flydende kvælstof, og opnår en øjeblikkelig glasagtig tilstand.

Langsom-fryse-procedure

Det første trin i langsom-fryse-proceduren er at udsætte cellen for kryoprotektant i en gradvis trinvis fasion for langsomt at tillade equilibrering af cellen med kryoprotektanten, mens vand frigives. Når cellerne er renset for הגדול part of cellulært vand, placeres cellerne i kryoprotektant-væsken i en beholder af nogle slags, såsom en plastik-strå, en glas-ampulle eller en plastik-vial. Volumen af væske omkring cellerne til langsom fryse er typisk mindre end en teskefuld og kan kun være nogle dråber. Den forud-mærkede beholder fyldes, tæt og puttes i en programmerbar fryseapparat, som langsomt reducerer temperaturen af beholderen over en periode af minutter eller timer til meget lave temperaturer. Efter nogle minutters afkøling skal starter iskrystaller dannes inde i beholderen ved at "seede" beholderen. Seeding udføres ved at bruge et værktøj (for eksempel, tang), som er forud-kølt i flydende kvælstof, for at røre beholderen og forårsage iskrystaldannelse. Denne starter-krystal vil initiere kontrolleret iskrystaldannelse et sted, sikkert væk fra cellerne. Når seeding er fuldført, kan resten af afkylnings-ramperne fortsætte. Når beholderen når temperaturer mellem -30 og -85 C, kan beholderen, der holder cellerne, dykkes direkte ned i flydende kvælstof for at fuldføre afkølingen til -196 C.

Vitrifikation

Ultra-rapid non-equilibrium afkylningsprocedurer som vitrifikation bruger højere koncentrationer af kryoprotektanter koblet med en næsten øjeblikkelig frysehastighed opnået ved at dykke celler direkte ned i flydende kvælstof. Vitrifikation omgår iskrystal-fasen og flytter vandet direkte til en glas-lignende fase. Vitrifikation opnår samme slutpunkt som langsom fryse, men med en hastighed på -3000C/min, sammenlignet med 10C/min eller mere. Til vitrifikation placeres celler normalt på spidsen af en strå, og ekstra kryoprotektant fjernes, så det netop er nok til, at cellen klæber til beholderen ved overfladenspænding, før den dykkes i flydende kvælstof. Fordi fryse er så hurtig, er varigheden af eksponering for kryoprotektanter meget mindre, og meget højere koncentrationer af kryoprotektanter kan tolereres af cellen. Opvarmning af cellen for at returnere den til normal metabolisk funktionsdygtighed skal også være utroligt hurtig. Håndtering af vitrifierede prøver er meget mere præcis end langsomt-frossne prøver, fordi endda en kort eksponering for en temperatur over flydende kvælstof kan starte en uplanlagt opvarmningsproces og genfryse, som er skadelig for cellen.