Sådan udføres en ELISA Assay

En ELISA eller enzymkoblet immunoabsorbentassay , er en biokemisk lab teknik gøres for at påvise et antigen ( såsom et protein ) eller antistof i en eksperimentel prøve. Assayet drager fordel af antistof-antigen- binding og kan anvendes til at analysere andre cellulære og molekylære bindende mekanismer samt. I et protein -baserede ELISA-assay , en "capture " antistof eller protein er fastlagt i en analyse og får lov til at klæbe til fadet , hvorefter " sonde " middel ( såsom ens protein af interesse ) er lagt ned og inkuberes med capture agent . Efter adskillige vaske en " påvisning " antistof tilsættes for at visualisere nærvær eller fravær af antistof-antigen- eller protein-protein- binding. Ting du skal
Assay fad (for eksempel 96 brønde blok)
Capture antistof ( fortyndet til 5 ug /ml i 50 mM NaHCO2 , pH 9,6)
Probe antistof /protein ( fortyndet til diverse koncentrationer)
antistof Detection (for eksempel peberrodsperoxidase -koblede antistof)
PT -buffer ( 1x PBS , 0,05 procent Tween -20)
Blokering buffer (1x PBS med 5 mg /ml BSA eller 5 procent skummetmælk i 1x PBS)
Detektionsreagens (dvs. TMB reagensblandingen )
Mekaniske laboratorium shaker
Kølerum eller køleskab
pipette og tips myHotelVideo.com: Vis mere Instruktioner

1

fortyndes indfangende antistof til 5 ug /ml i 50 mM NaHCO2 ( pH 9,6 ) . Der tilsættes 50 ul til hver brønd af prøven skålen anvendes til testning. Dæk med plast eller aluminium og inkuberes natten over ved 4 ° C på et rysteapparat .
2

Dump ud indfangningsantistof og vask to gange med 200 ul PT buffer. Tilsæt 200 pi blokeringspuffer per brønd ( PB eller 5 procent skummetmælk ) . Inkubér overalt fra to timer til natten over under omrystning ved 4 grader C.
3

Dump ud blokerende buffer, og vask 4 gange med 200 ul PT buffer. Tilføj " sonde " protein prøver ved forskellige koncentrationer i PB eller 5 procent skummetmælk , tilsætte 100 ul pr godt . Der inkuberes en time ryster ved 4 grader C. Dump ud probeopløsninger og vask seks gange med 200 ul PT buffer.
4

Tilføj detektionsantistof (HRP -konjugeret antistof) fortyndet 1:4000 i PB buffer eller 5 procent skummetmælk ( ene indeholdende 0,05 procent Tween -20) , tilsætning af 50 ul per prøve godt. Der inkuberes i 30 minutter til en time ryster ved 4 grader C.
5

Dump ud detektionsantistof løsning og vask 6 gange med 200 ul PT buffer per godt , efterfulgt af vask to gange med 200 pi 1x PBS ( phosphatpufret saltvand) . Dump ud PBS og tilsættes 100 ul detektionsreagens pr godt (for HRP , brug frisk blandet TMB reagens ved at blande TMB -substrat og peroxid på 1:1). Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur, idet lejlighedsvis .

Når anvendelse af TMB og HRP : Endelig tilsættes 100 ul 1M H3PO4 ( phosphorsyre) per brønd for at standse reaktionen TBM

Læs pladen ved hjælp af analyseprøve læseren , såsom en 96 -brønds plade -læser. . (For HRP og TMB , bruge " ELISA slutpunktssikkerhed Assay " skabelon tilgængelig på de fleste læsere. )
Hoteltilbud