kryopræservering procedurer
Cell -specifikke faktorer
De anvendte procedure til cryopreserve celler eller væv , afhænger af en række faktorer , herunder størrelsen af cellen , mængden af cellulære væske ( cytoplasma ) og kompleksiteten af cellen ( enkelt celle eller væv ) . Celler med en stor mængde cytoplasma såsom æg er vanskeligere at cryopreserve end celler med kun resterende cytoplasma , ligesom sædceller . Kryopræservering i æggestokkene væv er mere udfordrende , fordi mindst tre forskellige celletyper af forskellig størrelse er til stede i æggestokkene væv , hver med forskellige optimal nedfrysning behov . Slow-frysning protokoller er blevet anvendt med succes med forskellige typer af celler . Forglasning øjeblikket er mest effektivt med encellede frysning og mindre effektive med væv , men forskningen er i gang for at optimere forglasning af væv .rolle Cryoprotectants
Den cytoplasma en celle indeholder vand , som skiftes til at iskrystaller ved frysepunktet . Når isen danner inde i en celle , cellen er makuleret og dør . Derfor væsken i cellen skal fjernes , før det når temperaturer under frysepunktet for at undgå celleskader . Forskellige typer af frostvæske ( kryoprotektant ) væsker kan bruges til at dehydrere cellen før frysning , herunder glycerol , propandiol , dimethyl sulfoxde ( DMSO ) , ethanol og sukker som saccharose og trehalose . Den optimale graden af køling ( og optøning ) afhænger af den anvendte type kryoprotektant og den karakteristiske af cellen eller væv for at være ( eller det var ) frossen . Cryoprotectants er giftige for metaboliske cellerne, så celle engagementer cryoprotectants ved varmere metaboliske temperaturer skal minimeres eller undgås . Efter optøning eller opvarmning af celler, skal cryoprotectants fjernes helt fra cellen , før metaboliske aktivitet er genoprettet .Equilibrium versus ikke-Equilibrium Kryopræservering Procedure
Satsen for indefrysning afhænger af, om indefrysningen protokollen er ligevægt eller intet-equilbrium-baseret. For ligevægt type procedurer , er det optimale frysning , der opnås , når der er en balance mellem den hastighed, hvormed cellen bliver dehydreret af vand og den hastighed , hvormed vandet udenfor cellen bliver omdannet til isen scenen . Disse ligevægt eller langsomt fryse protokoller normalt tage timer at gennemføre , og en computer bruges til at køre en programmerbar sats fryser for at sikre, at indefrysningen satser er nøjagtig som du ønsker . Der er typisk en "hold " skridt i protokollen nær starten at tillade manuel oprettelse af starterkulturer iskrystaller eller " seeding " i væsken udenfor cellerne .I forglasning , er en helt anden tilgang til nedfrysning , som ikke er afhængige af ramper og opnå en balance mellem dehydrering og is krystal formation, der anvendes . Forglasning er så ultra-hurtigt, at der ikke er tilstrækkelig tid til is dannelse og den cellulære væske omdannes direkte til en glasagtige eller glas fase , uden at beskadige cellen . Programmerbare sats frysere er ikke nødvendige, fordi cellen direkte er kastet ud i meget koldt flydende nitrogen , opnå en øjeblikkelig glasagtig tilstand .
Slow-Freeze Procedure
Det første skridt i slow- fryse procedure er at udsætte cellen for at kryoprotektant i en gradvis trinvis måde langsomt at give ligevægt i cellen med kryoprotektant mens slippe vand . Når cellerne er blevet renset for de fleste af cellulære vand , er cellerne i kryoprotektant væske anbringes i en beholder af en slags , såsom en plastik strå , et glas ampule eller en plastik vial. The væskevolumen omkring celler langsom nedfrysning er typisk mindre end en teskefuld og kan kun være et par dråber . Den præ- mærket beholder er fyldt , forseglet og sat i en programmerbar fryser , der langsomt sænker temperaturen i beholderen over en periode på minutter eller timer til meget lave temperaturer . Efter et par minutter til at køle , skal starteren iskrystaller dannes inde i containeren med " seeding " beholderen . Såning udføres ved hjælp af et redskab ( for eksempel , tang ), der har været præ- kølet i flydende kvælstof til at røre beholderen og forårsage dannelse af iskrystaller . Denne forret krystal vil indlede kontrolleret dannelse af iskrystaller på ét sted , sikkert væk fra cellerne . Når seeding er færdig, resten af afkøling ramper kan fortsætte . Når beholderen når temperaturer mellem -30 og -85 C , beholderen holder cellerne kan blive kastet ud direkte i flydende kvælstof for at fuldføre afkøling til -196 C.forglasningsanlaegget
Ultra-hurtig ikke-ligevægt køling procedurer såsom forglasning anvende større koncentrationer af cryoprotectants kombineret med en næsten øjeblikkelig nedfrysning , der opnås ved kaster celler direkte ind i flydende kvælstof . Forglasning omgår is- krystal formation fase og flytter vand direkte ind i et glas -lignende fase . Forglasning opnår samme endpoint som langsom frysning , men med en hastighed på -3000C/min , sammenlignet med 10C/min eller mere . For forglasning er celler som regel placeret på spidsen af et strå og overskydende kryoprotektant fjernes , så kun nok til, at cellen klamrer sig til beholderen ved overfladespænding , inden kaster i flydende kvælstof . Fordi frysning er så hurtig , varigheden af eksponeringen for cryoprotectants er langt mindre , og meget højere koncentrationer af cryoprotectants kan tolereres af cellen . Opvarmning af cellen til at returnere det til den normale metaboliske funktion skal også være utrolig hurtig . Håndtering af forglasset prøver er meget mere krævende end langsomt frosne prøver , fordi selv en kortvarig påvirkning til en temperatur højere end i flydende kvælstof kan starte en uplanlagt opvarmning proces og genindfrysning , som er ødelæggende for cellen .Relaterede Sundhed Artikler