Western Blot-test: Principper, procedure og anvendelser

Baggrund

Da antallet af HIV- og AIDS-tilfælde steg verden over, blev behovet for præcis HIV-testning afgørende. Nu bruger medicinske fagfolk en Western blot-test til at bekræfte en positiv HIV-infektion efter positive ELISA HIV-tester. Læger diagnosticerer også Lyme-sygdom gennem Western blot-testing. Testen bruger komplekse detektionsmetoder: medicinske arbejdere skal overføre blodprøver fra et gel til en membran for at lette detektionsprocessen. For faktisk at identificere antistoffer i membranen bruger arbejderne specifikke enzymer, substrater og/eller fluoroforer.

AP-enzym (Alkalinsk fosfatase)

Alkalinsk fosfatase (AP) udgør et af de primære enzym i Western blot-testing. AP har en lineær reaktionstid, hvilket giver det en detektionsfordel frem for andre enzymer. Jo længere tid en AP-reaktion har til at finde sted, desto mere præcis bliver testen. Dog kan den længere periode opsamle andre kemiske forbindelser og "baggrundsstøj", som kan forvrænge testresultaterne.

HRP-enzym (Horseradish peroxidase)

Medicinske arbejdere anser horseradish peroxidase (HRP) for overlegen AP på grund af HRPs mindre størrelse, høje aktivitetsrate, kompatibilitet med reaktionsmembranen, pålidelighed, lav pris og bred tilgængelighed.

Kromogene substrater

Medicinske fagfolk anser kromogene substrater for bedst til visning af den indre membranreaktion af blod og enzym. Kromogene substrater er ikke så følsomme som andre substrater og tenderer til at forsvinde, mens blottet tørrer. Men til en hurtig visuelt testbekræftelse gør kromogene substrater en effektiv valg.

Kemiluminescens-blotting-substrater

Kemiluminescens-blotting-substrater kræver en konstant reaktion for en vellykket test. Hvis enzymet ophører aktiviteten eller substratet udtømmes, går testresultatet tabt. Ved en optimal test bliver resultatet tilgængeligt på 1 til 24 timer. Medicinske arbejdere bruger digital billedudstyr eller røntgen for at se testresultatet, da det blotte øje ikke kan detektere det.

Fluoroforer

Hvis medicinske arbejdere ikke tester med enzymer og deres respektive substrater, bruger de fluorofor-konjugerede antistoffer. Fluorofor-testen kræver færre trin, men har brug for specielt udstyr. Testen kræver en ekscitationslys kilde, der forårsager den korrekte reaktion i membranen. Fluoroforer og lysudstyr er dyre, men medicinske arbejdere har fordel af at bruge flere fluoroforer i det samme eksperiment.