Ammoniumklorid lyse af røde blodceller: Osmotisk mekanisme & laboratoriebrug

Ammoniumklorid (NH₄Cl) lyserer røde blodceller (RBC'er) via osmotisk lyse, ved at udnytte RBC-membranets unike permeabilitet for NH₃/NH₄⁺.

Mekanisme

1. NH₄Cl dissocierer: NH₄⁺ + Cl⁻.
2. NH₃ (uladet) diffunderer hurtigt IND i RBC (høj permeabilitet).
3. Inde i RBC (pH ~7,2): NH₃ + H⁺ → NH₄⁺ (fanget).
4. Intracellulær [NH₄⁺] stiger → ↑ osmolaritet → vandindstrømning → svulst → revne.
5. Cl⁻ følger eller indgår via anion-eksanger (AE1/Band 3).

Hvorfor det er selektivt for RBC'er

• RBC'er mangler mitochondrier → ingen urea-cyklus til at detoxificere NH₄⁺.
• Høj NH₃ permeabilitet (AQP1, RhAG kanaler).
• Kernede celler (HVBC'er) metaboliserer NH₄⁺ via glutamin-syntetase; modstår lyse.

Standardprotokol (ACK Lyseringsbuffer)

• Sammensætning: 150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2–7,4.
• Koncentration: ~0,8% NH₄Cl (8 g/L) – tæt på de anførte 0,9%.
• Procedure: Tilføj 1–5 mL buffer per 1 mL blod; inkuber 2–5 min ved RT; centrifuger; vask.
• Temperatur: Stuetemperatur optimal; 4°C forsinker lyse.

Anvendelser

• Lyser RBC'er i helblod til HVBC-analyse (flow cytometry, DNA/RNA ekstraktion).
• Blodtypering (fjern RBC-støj).
• Perifer blod mononukleære celle (PBMC) isolering (efter Ficoll).
• Benmarg / milt behandling.

Begrænsninger & Alternativer

• Kan skade HVBC'er hvis forlanget (>10 min) eller høj koncentration.
• Ikke til funktionelle assays krævende intakte membraner.
• Alternativer: Hypotonisk vand (hurtigere, hårdere), kommercielle RBC-lysebuffere (f.eks. BD Pharm Lyse, eBioscience).

Sikkerhed

• NH₄Cl er irritant; brug handsker, beskyttelsesbriller.
• Affald efter institutionelt kemisk affaldsprotokol.