Sådan måler NADH

NAD og NADH er begge pyridinnukleotider involveret i stofskiftet. NADH og NAD er co-enzymer findes i mitokondrier , kraftcentre af cellen . Både NAD og NADH er involveret i cellulære reaktioner såsom respiration og fotosyntese , hvor energi og hydrogen er genereret. NAD og NADH brændstof biokemiske reaktioner , som kræver en række enzymer til at producere ATP , den vigtigste energikilde i celler. Ting du skal
Celler eller væv under undersøgelse
NADH assaykit
phosphatpufret saltvand
Dry Ice
Varmeblok
plade med 96 brønde
Centrifuge
Labeled rør
Plate læser
Vortex
kendt koncentration af NADH myHotelVideo.com: Vis Flere Instruktioner
Assay
1

vaske celler eller væv under studie med kold fosfat saltvand , PBS. Uddrag celler eller bryde op væv i ekstraktionsbuffer ved at placere blandingen på tøris i 20 minutter og derefter ved stuetemperatur i 10 minutter. Gentag .
2

Vortex i 10 sekunder. Spin i en centrifuge i 5 minutter for at pelletere celle eller vævsrester . Fjern supernatanten , den flydende fase , og placer væsken i et rent glas .
3

filtreres supernatanten gennem et specialiseret filter til at fjerne enzymer, der vil opdeling NADH .
4

Fjern 200 mikro liter, sted i et rent glas og varme ved 60 grader Celsius i en varmeblok i 30 minutter for at denaturere NAD . Cool og centrifuge og fjerne flydende fase. Overfør 50 mikroliter i en 96-brønds plade; hver prøve skal være i to eller tre . For at bestemme den samlede NAD , NADt ikke varme.
5

Forberede og tilføje cykling mix til 96-brønds plade. Bland og inkuber i 5 minutter. Der tilsættes 10 mikroliter udvikler og lader til at inkubere ved stuetemperatur i op til 4 timer. Tilføj stop løsning . Læs farveskift på en plade -læser eller fluorimeter afhængigt af kit.
Standardkurve og Beregning
6

Forbered en standardkurve ved at tage en kendt koncentration af NADH og fortynde det i udvinding buffer. Fortynd i forskellige koncentrationer , der sikrer afslutningen volumen forbliver den samme som prøverne . Plade på samme plade med 96 brønde som testprøver . Aflæs optisk densitet.
7.

Tegn standardkurve graf med koncentration på X-aksen og optisk tæthed på Y-aksen . Tage et gennemsnit af hver prøve og læse koncentrationen fra standardkurven grafen.
8

Beregn NAD /NADH -forholdet ved at fratrække total NAD , NADt fra NADH og derefter dividere med NADH .