Sådan Detect NADH

nicotinamid adenin dinuceltoide ( NADH ) , forkortet " NAD ", er et coenzym findes i levende celler , der producerer kemiske reaktioner i proteiner. Farmaceutiske virksomheder studere NADH på grund af dets metabolisme proces og syntetisk skabe det for en række formål . Da NADH er mikroskopisk , kan det blotte øje ikke få øje på det . Du har brug for videnskabelige test og en test -kit til påvisning af sin tilstedeværelse. Ting du skal
Tøris
Micro- centrifuge
Eppendorf-rør myHotelVideo.com: Vis mere Instruktioner
Reagensrekonstituering
1

Indstil cykling buffer på en tæller og tillade buffer til at nå stuetemperatur. Den ideelle temperatur for bufferen er 22 grader celsius.
2

Opløs NAD cykling enzym mix med præcis 220 mikroliter cykling buffer. Frys løsningen i temperaturer under -70 grader celsius.
3

opblandes NADH bygherren med 1,2 ml ddH2O . Bland forsigtigt opløsningen, indtil den er helt opløst. Må ikke vortex.
4

Opløs NADH standard med 200 mikroliter ren dimethylsulfoxid .
Prøveforberedelse
5

Vask cellerne med phosphatpufret saltopløsning .
6

Pellet 2x10 ( 5 ) celler for hver enkelt analyse i en mikro- centrifugeglas og køre ved 2.000 rpm i 5 minutter .
7

Uddrag af cellerne med 400 mikroliter NAD /NADH ekstraktionspuffer ved frysning og optøning af cellerne i to cyklusser - 20 minutter på tøris og 10 minutter ved stuetemperatur. Vortex det udtrukne celler i nøjagtig 10 sekunder.
8

Spin celleprøver i en mikro- centrifuge ved 14.000 RPM i nøjagtig 5 minutter.
9.

Overfør NAD /NADH celler i et rent glas .
forsøgsforskrift
10

Fortynd 10 mikroliter af NADH standard med 990 mikroliter NAD /NADH udvinding buffer . Tilføj 0, 2, 4, 6, 8, 10 mikroliter af den fortyndede opløsning i en 96 -brønds plade i to eksemplarer for at skabe 0, 20 , 40, 60 80, 100 og standard. Fyld sidste brønd med 50 mikroliter af NAD /NADH ekstraktionsbuffer .
11

Transfer 50 mikroliter af de ekstraherede celleprøver i en 96 -brønds plade i dubletter som før.
12

Forbered celleprøver for NADH detektion. Dekomponere NAD fra celleprøver ved at sætte 200 mikroliter af de ekstraherede celleprøver i eppendorfrør . Varm rørene til 60 grader celsius i nøjagtigt 30 minutter i et temperaturstyret vandbad. Hurtigt afkøles prøverne ved at anbringe rørene på is. Spin prøverne i mikro- centrifuge for at fjerne bundfald. Overførsel 50 mikroliter af den opløste prøver i en 96 -brønds plade i duplikater som før.
13

Bland NAD cykling buffer blandes med 100 mikroliter NAD cykling buffer mix og 2 mikroliter NAD cykling enzym. Tilsæt 100 mikroliter af denne nye løsning i hver brønd af NADH standarder og prøver.
14

Inkubér pladen ved stuetemperatur i nøjagtig 5 minutter. Denne proces konverterer NAD til NADH .
15

Tilsæt 10 mikroliter NADH udvikler i hver brønd. Lad pladen stå ved stuetemperatur i mindst 1 time og højst 4 timer.
16

Læs pladen og beregne NADH .