Hvordan kan man foretage en FRET Indhold

Fluorescensresonansenergioverførsel ( FRET ) er en analyse teknik, der anvendes til at måle tilstedeværelsen og mængden af ​​binding mellem to reporter -linked proteiner. Denne analyse er almindeligt anvendt til at analysere potentielt bindende proteiner i forskellige typer af celler , og for at måle effektiviteten af ​​konjugering -type enzymer. Den sporingsudstyr behov for, afhænger i høj grad af den slags reporter molekyler bliver brugt , selvom mange gange kan bruges en simpel 96-brønds plade læser . Ting du skal hoteltilbud Protein-of-interest/Reporter molekyle konstruerer for hvert protein bliver testet
96 -brønds plade blok
96 -brønds plade læser
Reaktionsbuffer (generelt Tris- eller fosfat - bufferet - saltvand -baseret)
Konjugation enzym ( om nødvendigt)
Vis Flere Instruktioner
Setup og Reading
1

Generer eller forberede fusion konstruktioner af hvert protein af interesse , hvor hver er knyttet til en fluorescens transmission molekyle, såsom grønt fluorescerende protein ( GFP) , rhodamin eller bor - dipyrromethene ( BODIPY ) .
2

Bestem absorbans og emissionsbølgelængder for hver fluorescerende komponent og den generelle assay. ( For eksempel, hvis assayet måler GFP -> rhodamin fluorescens energioverførsel, input absorbans bølgelængde er, at GFP s absorbans ( 488 nm ) og påvisning emissionsbølgelængden er, at for rhodamin ( 595 nm) )
.
3

Opret passende reaktion buffer for eksperimentet , afhængigt af proteiner af interesse biokemiske egenskaber. En TRIS - buffer er ofte anvendes, herunder calciumchlorid og 0,05 procent Tween-20 . Bestemte fusioner og komponenter kan bestemmes ved at søge efter journaloptegnelser beskriver lignende reaktioner og betingelser.
4

Bland de to reporter -konjugerede proteiner af interesse i forskellige koncentrationer i reaktionsbufferen , og alikvot 50-200 ul per brønd . Tilføj en konjugering enzym ( for eksempel sortase ) til hver prøve godt, hvis det er relevant. Hvis der udføres et slutpunkt assay , tillade inkubation ved stuetemperatur ( eller enzymets optimale temperatur) i en bestemt periode, så læs videre 96 -brønds plade læser . Hvis der udføres en kinetik assay , gå direkte til at læse (se nedenfor) .
5

Indsæt prøve plade i 96 -brønds plade læser . Opret et nyt eksperiment , og få adgang indstillingsmenuen . Input af den korrigerede absorbans (excitation ) og emissions- bølgelængder , og vælg derefter de relevante brønde, der skal læses .
P Hvis du udfører en kinetik eksperiment , indstille tiden - løbet af forsøget og aflæsninger interval periode (såsom en gang hver 10 minutter).

begynde at læse prøve.

analysere data ved hjælp af Microsoft Excel graftegning funktion ( eller en anden graftegning program som GraphPad ) .