Cell Surface Biotinylering protokol

Biotinylering bruger evne til opløselige vitamin biotin binder til celleproteiner . Biotin binder til proteinet strepavidin og er derfor anvendelige i cellebiologi at visualisere celleproteiner . Biotinylering tillader sikker mærkning af proteiner i forhold til teknikker, såsom radioaktivitet, og ikke påvirker cellens normale funktion . Det gør det muligt for forskerne at studere celle- proteiner, såsom receptorer , og som giver en større forståelse af sygdomme og sygdomsprocesser. Mærkningsordninger suspenderede celler

Vask cellerne i iskold phosphatpufret saltvand (PBS) for at fjerne forurenende stoffer. Puffere indeholdende tris og glycin vil konkurrere med biotinylering og bør undgås . For at undgå at biotinylering interne proteiner , kan mærkningen udføres ved 4 grader Celsius eller i overværelse af azid . Resuspender cellerne i PBS og den opløselige biotin, sulfo -NHS -LC -biotin .

Mærkning adhærente celler

Vask cellerne i PBS og inkuberes med et produkt som sulfo -NHS - LC- biotin. Cellerne skrabes ind i et fad og lyseret i en buffer indeholdende detergent Triton -X 100 og forberedt til visualisering.
Forberedelse mærkede celler

Følger inkubering centrifugeredes cellerne i et pellet og vasket i PBS . Cellerne resuspenderes i PBS og oprenset med IgG Sepharose gel. Det bundne protein fortyndes i fyldningspuffer og opvarmes til 100 grader Celsius.
Visualisering Celler

Udvandet proteiner kan visualiseres ved hjælp natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS- PAGE ) efterfulgt af blotting med proteinet og enzymblanding , streptavidin - peberrod peroxid. Blots visualiseret med en kemisk reaktion --- kemiluminescens --- som udsender lys . Egenart biotinyleringen kan bekræftes med antistoffer for proteinet under studiet.
Hoteltilbud