Sådan måler Cell levedygtighed

I de fleste biologiske eksperimenter involverer cellekultur , et afgørende skridt omfatter at vide, hvilke celler er i live og som er døde i din prøve . Dye udelukkelse er den mest populære metode til at måle cellernes levedygtighed . Farveeksklusion er baseret på teorien om, at levende celler indeholder intakte membraner og døde celler ikke , og dermed døde celler absorberer farvestof i cytoplasmaet. Der er forskellige farvestoffer og protokoller og de ​​metoder, du vælger, skal være baseret på omkostninger , følsomhed, lethed og længden af ​​proceduren. Trypan blåt er et almindeligt farvestof anvendes til at måle cellelevedygtighed , fordi fremgangsmåden kan udføres i fem til 10 minutter og koster kun den mængde af farvestoffet reagens. Ting du skal
0,4% trypanblå reagens
hæmacytometer
Cover slip
Mikropipette
Pipettespidser
fosfatbufferet saltopløsning ( PBS)
Lysmikroskop

Vis Flere Instruktioner
1

Anskaf en pellet af cellerne du måler .
2

Resuspender cellepelleten i PBS for at få cirka 5 x 105 celler /ml . PBS anvendes, fordi levedygtighedsmålinger er mere nøjagtige, når cellerne er i et serum- frit miljø; serumproteiner kan også plette og give dig misvisende resultater .
3

Tilføj lige dele celle suspension i PBS til lige dele af 0,4% trypanblå farvestof for at opnå en 1 til 2 fortynding ( fx : . 100 ul celler til 100 ul af trypanblå ) og blandes ved pipettering op og ned
4

Inkuber blanding i mindre end tre minutter ved stuetemperatur . Hvis cellerne tælles efter cirka fem minutter, vil levedygtighed være upræcis pga. celledød.
5.

Med dækglasset allerede på plads, fylde hver side af en hæmacytometer tæller med cellesuspensionen . Typisk vil hver side tage 10 til 20 ul.
6

Placer hæmacytometer på scenen af ​​et lysmikroskop og fokus på cellerne .
7.

Hver side af den hæmacytometer indeholder flere kvadrater. Tæl det samlede antal celler i et kvadrat af hæmacytometer . Tælle derefter antallet af ikke-levedygtige (blå) og levedygtige (klare ) celler separat, på den samme plads .
8

Procentdelen af levedygtige celler på pladsen ved at dividere antallet af levedygtige celler af det samlede antal celler og gange med 100 . Gør dette for flere pladser på hæmacytometer at opnå en gennemsnitlig levedygtighed måling.
Hoteltilbud