Western Blot Instruktioner

Western blot-analyse er en velkendt teknik til at identificere specifikke proteiner isoleret fra væv . De forskellige proteiner separeres først ved opladning og vægt på SDS- polyacrylamidgel og overført til en nitrocellulosemembran . Efter overførsel , mærkede antistoffer binder specifikt med det ønskede protein og fotograferet under anvendelse af røntgenfilm eller visualiseres ved protein - specifik farvning . Det endelige resultat viser mørke bånd , der angiver tilstedeværelsen af ​​det identificerede protein. Denne artikel fokuserer på den grundlæggende metode til at udføre Western blot-analyse i et laboratorium kvalificeret til komplekse protein forskning. Ting du skal
SDS- polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE ) med adskilte proteiner
Nitrocellulose membran
Destilleret vand
Transfer buffer (30 g Tris, 144 g Glycin og 200 ml methanol i 1 l vand )
Filtrerpapir , Whatman 3 mm
Laboratory svamp
Western blot transfer kammer
Laboratory strømforsyning
Laboratory køleskab
Laboratory agitator
Tris saltvandsopløsning ( TBS) ( 24,2 g Tris Base , 80 g NaCl i 1 l vand)
Blokering opløsning (5 procent nonfat mælkepulver i TBS) hoteltilbud Primært antistof løsning
mærket antistof konjugatopløsning
Alkalisk phosphatasesubstratopløsning med nitro blå tetrazolium plet
Fosfat saltvand (PBS)
Gel - imager kasse,
Vis Flere Instruktioner
Overfør Proteiner til nitrocellulosemembranen
1

Forbered nitrocellulosemembranen . Membranen bør lægges i blød i destilleret vand i to minutter og derefter anbragt i overførselsbufferen og lov til at trække i fem minutter.
2

Saml en overførsel sandwich bestående af svamp /filter papir /SDS PAGE /nitrocellulosemembran /filtrerpapir /svamp. Sandwichen afstemt så membranen ligger tættere på anoden og gelen tættere på katoden i overførslen kammeret.
3

Tilføj overførselsbuffer i kammeret , så sandwich er neddykket . Placer kammeret inde i laboratoriet køleskab. Overførsel af protein fra gelen til membranen skal udføres ved 4 grader celsius.
4

Opsæt strømforsyningen til at overføre proteiner fra gelen på membranen . Retningen af ​​overdragelsen er mod anoden angivet af den røde ledning. Større proteiner bevæge sig hurtigt som reaktion på en elektrisk strøm og vil bevæge sig først. Strømforsyningen kontrollerer hastigheden for overførsel. Sæt strøm til 30 V og 40 mA for en overnatning overførsel.
5.

Skil strømforsyningen , når overførslen er færdig. Må ikke komme i kontakt med transfer buffer eller fjern sandwich mens strømforsyningen er tilsluttet.
6

Fjern membranen fra sandwich og inkuberes i to timer i blokerende opløsning . Proteiner i blokerende opløsning vil absorbere ind i membranen , hvor ingen proteiner er til stede . Det vil forhindre enhver antistof fra binding til membranen , hvor det ønskede protein ikke er til stede .
Bindende Antibody
7

Inkubér nitrocellulosemembranen med primært antistof løsning med en omrører. Membranen skal være fuldstændig neddykket i opløsning i mindst en time. Det er acceptabelt at inkuberes natten .
8

Vask membranen grundigt for at fjerne ubundet antistof . Fire separate 10 minutters vask med TBS er normalt tilstrækkelig til at fjerne overskydende antistof.
9.

Inkubér membranen i mærket antistof konjugatopløsning hjælp af omrører. Membranen skal inkuberes i mindst en time. Det mærkede antistof konjugat er bundet til alkalisk phosphatase. Det er det enzym -antistof- mix, der vil genkende og binde sig til det første antistof .
Påvisning af protein
10

Skyl membranen i 10 minutter i PBS fire gange . Dette vil fjerne den resterende del af det mærkede antistof -konjugat .
11

inkuberes membranen i alkalisk phosphatasesubstratopløsning indtil båndmønstre vises. Farvestoffet i substratopløsningen vil binde til antistof-antigen - protein i membranen og danner en mørk - farvet bånd . Processen kan være umiddelbar eller kræve op til 30 minutter, før de bands overholdes.
12

Wrap membranen helt i cellofan og placere den direkte på gelen - imager at visualisere resultaterne. Gel- imager er i stand til at fotografere de resultater, der vises på Western blot membran.
Hoteltilbud