Sådan foretages fejlfinding af en tre Fragment æggelederne

æggelederne er en metode, der anvendes i biologisk forskning til samling adskilte DNA-strenge . Processen er blevet forenklet anvendelse af kommercielt tilgængelige ligation kits. En ligatur procedure følges almindeligvis af transformation, en proces indsætte indtrådt DNA i en bakteriel vektor modtager, til at klone og forstærke DNA. På grund af kompleksiteten af fremgangsmåden ofte resultater ikke svarer til det ønskede produkt og kræver fejlfinding. Dette er mere fremherskende i et forsøg på at deltage i flere fragmenter, såsom i tredobbelt ligering. Ting du skal
ligeringskit
æggelederne protokol
Agarosegel
50 X TBA buffer (242 g Tris base, 57,1 ml iseddike , 100 ml 0,5 M EDTA fortyndes til 1 liter med vand )
Demineraliseret vand
DNA-oprensning kit myHotelVideo.com: Vis Flere Instruktioner
fejlfinding transformation
1

Formulere en liste over trin involveret i ligatur og transformation. Fejlfinding nogen videnskabelig protokol generelt begynder med det sidste trin , der arbejder baglæns .
2

Sammenlign renset DNA-produkt fra prøven til kontrol-DNA , der leveres med kittet . Når DNA er blevet transformeret og klonet i bakterier , kan den isoleres , oprenses og kontrolleres ved agarosegelelektroforese . Resultaterne for elektroforese vil indikere, om transformation var vellykket.
3

Bestem bakterievækst under kloning. De fleste bakterievektorer er konstrueret så kun dem med en DNA- insert - vil vokse på et medium, der indeholder ampicillin eller andre antibiotika . Dårlig vækst kan fastslå, at DNA-prøven ikke lykkedes indsat i vektoren.
4

Bekræft, at ligeret DNA-prøve blev renset , før transformation. Buffer salte og ligatur enzymer kunne hæmme omdannelsen af ​​det indsatte DNA . Det er også vigtigt at fastslå, at ligering enzymet blev inaktiveret ved varme, efter afslutning af ligering procedure. Aktiv ligase potentielt kunne forstyrre transformation.
5.

Kontroller dato bakterielle materiel, der anvendes til transformation. Gamle bakterieceller mister effektivitet over tid. Til sidst bakterieceller er i stand til transformation og kloning kvalitet. Når processen med transformation er blevet diagnosticeret , kan du begynde at analysere ligatur procedure .
Fejlfinding æggelederne
6

Bekræft renheden af ​​dit DNA-prøve , før ligering . Salt forurenende stoffer i DNA-prøve kan resultere i dårlig ligatur . DNA-prøven skal være renset og fri for salte og enzymer , før det anvendes i ligatur .
7.

Bekræft, om enderne af DNA-strenge , der skal ligeres er sløve eller klistret. Ligering anvendes til at forbinde separate tråde med stumpe ender eller kohæsive ender efter fordøjelse med udpegede restriktionsenzymer. T4 DNA-ligase er det enzym valg for stumpendet DNA - men det vil også arbejde for DNA med klæbrige ender . Andre DNA-ligaser kan kun arbejde for DNA , efter en restriktionsfordøjelsesprodukt at skabe klæbrige ender . Det er vigtigt at bruge den korrekte ligase for den testede DNA.
8

Kontrollér koncentrationen af ​​DNA-prøver før ligatur . Anvendelse af DNA med høj koncentration ofte forårsager DNA bliver lineær. De kit instruktioner vil give oplysninger om den korrekte mængde af DNA til brug i en ligeringsreaktion .
9.

Erstat ligaseenzym med et nyt parti. Enzymer er særligt følsomme over ved stuetemperatur og fortsatte fryse-tø cykler . Den ligase kan blive beskadiget efter en række anvendelser , blot ved frysning og optøning for mange gange. Nogle kits anbefaler, at ligase alikvoteres i mindre portioner i starten under brug , for at reducere antallet af gange, det er re- frossen .
10

Kontroller ligeringskit . Ofte er problemet med ligatur bruger et kit, der er udløbet eller er blevet forurenet med andre DNA og salte.
Hoteltilbud