Sådan Test for Nucleic Acids

Test for nukleinsyrer udføres i medicinsk diagnostik for at opdage patogener , såsom vira eller bakterier. Disse tests er meget hurtigere , og derfor gøre det muligt for en læge til at starte behandling for en patient, der normalt ville have haft til at vente på bekræftelse af smitte ved hjælp af mere langvarige og kedelige antistofbaserede assays. Processen er også kendt som en nukleinsyreamplifikation prøve, og indbefatter en fremgangsmåde kendt som " reverse- transkriptase forstærkning" ved polymerasekædereaktion . Da dette er et højt specialiseret videnskabelig procedure , avanceret viden og ekspertise i molekylærbiologiske teknikker og der er behov for teori . Hvad du har brug
PCR-rør
PCR cycler
pipetter og filter tips
Handsker
Celler
Trizol eller andre RNA ekstraktionsreagens
PCR-buffer
Taq polymerase
RT- PCR primere ved 1 mg /ml koncentration
RNase -frit vand
dNTP'er
MgCl2
Tilfældige primere på 1,8 mg /ml koncentration
SuperScript II reverse transkriptase

Vis Flere Instruktioner
forarbejdning og tilberedning af RNA
1

Harvest celler med en RNA ekstraktion reagens, såsom Trizol . 1 ml er tilstrækkeligt til at indsamle celler fra en brønd i en seks- brønds vævskulturplade . Cellerne grundigt pipetteret op og ned for at homogenisere dem og derefter udføre ekstraktionsprocedure som beskrevet i Trizol dataarket. Kort fortalt ekstraheres med chloroform, hvorefter den centrifugeres for at adskille faserne af DNA , protein og RNA. Recover kun den farveløse RNA fase og udfældes der med isopropanol. Efter inkubering centrifuger der og rydde op den resulterende pellet med flere ethanol vaske. Så pellet resuspenderes i RNase -frit vand .
2

revers transkription , denaturere nøjagtig 5 mikrogram RNA ved 65 grader Celsius i en 10 mikroliter ( ul ) omfanget af RNase -frit vand , derefter hurtigt placeres på is. For hver reaktion kombinere 10 ul af RNA , 3 ul 10X PCR reaktion buffer , 2,5 ul 10 mM dNTP, 6 l 25 mM magnesiumchlorid, 1 ul af tilfældige primere på 1,8 milligram per milliliter koncentration, og 0,5 ul SuperScript II revers transkriptase -enzym. Fyld hver reaktion med 17 ul af RNase -frit vand . Inkuber rørene ved stuetemperatur i ti minutter og derefter ved 42 ° C i en time til fremstilling af cDNA og derefter denatureres ved 95 grader Celsius og hurtigt is for at standse reaktionen .
3

for en polymerasekædereaktion , igen oprettet en reaktionsblanding i 0,5 ml rør ved at kombinere 6 ul cDNA fremstillet i revers transkription- reaktion , 1,5 ul 10X PCR reaktion buffer, 0,2 mikroliter Taq-polymerase , 0,5 mikroliter omvendt primer og også af fremad-primer , så toppen af hvert rør med 10,3 ul RNase -frit vand . For at køre reaktionerne , der er nedsat en thermocycler (dvs. en maskine, der udfører polymerasekædereaktioner ) i 30 cyklusser som følger: 95 ° C i 0,5 minutter til denaturering , efterfulgt af 60 grader celsius i 45 sekunder til at anneale , og endelig 72 grader Celsius i 1 minut for at udvide den syntetiserede udskrift .
hoteltilbud