Fejlfinding for Gelelektroforese

Polyacrylamidgelelektroforese eller side , er en teknik, der almindeligvis anvendes til adskillelse af organiske molekyler i en biologisk prøve . Molekyler med lavere størrelse og vægt migrere hurtigere på en polyakrylamidgel når der påføres en elektrisk strøm . Klare distinkte bånd er generelt observeret efter afsluttet gel inkuberes i en bestemt plet . Det er en relativt enkel metode. Fravær af bands eller bands, smøre eller er urene kunne dog tyde på et problem i et eller flere trin af metoden. Du bør følge de grundlæggende retningslinjer for at fejlfinde en gelelektroforese metode, når dine resultater er ikke som forventet. Ting du skal
kvalitetssorteringen bis : acrylamid eller præfabrikerede plader
to glasplader
Akrylamid : Bis
TBE (Tris , borsyre, EDTA)
Strømforsyning
Upper pufferkammeret
Lavere pufferkammeret
Protein af DNA-prøve
TEMED
ammoniumpersulfat
Gel plet myHotelVideo.com: Vis Flere Instruktioner
1

Start med det sidste trin af gelelektroforese første og arbejde baglæns . For gelelektroforese det sidste trin er farvningsproceduren bruges til at observere prøven bands. Få problemer bør faktisk forekomme under farvningsproceduren . Imidlertid bør pulveriserede pletter være godt opløst i den passende puffer , før de anvendes til farvning af en gel. Fastslå den korrekte koncentration af pletten blev brugt.
2

Kontroller strømforsyningen . Fraværet af bands kunne tyde strøm eller spænding indstilling var for høj og prøverne migreret fra gelen. Høje indstillinger kan også forårsage prøvekomponenterne at migrere gennem gelen for hurtigt, hvilket fører til dårlig opløsning og bands , der vises urene . Prøver kan ikke migrere gennem gelen , hvis indstillingen strømforsyningen er lav. Prøver kan også drive fra brønden , hvor de blev læsset og ikke vandrer gennem gelen.
3

Kontroller flydende acrylamid bruges til at kaste polyacrylamidgelen . Typisk procentdel af acrylamid anvendes til at kaste en polyacrylamidgel varierer fra 5 til 15 procent. Prøver bestående af større molekyler er indlæst på en 5 procent gel, da store fragmenter bevæger langsommere på geler med en højere acrylamid procentdel. Små molekyler er lastet på et højere procent gel, da en lav koncentration gel ikke ville være i stand til at løse mindre prøver .
4

Kontroller reagenser, der anvendes til at polymerisere acrylamid . En polyacrylamidgel er dannet ved polymerisering af en flydende blanding bestående af bisacrylamid og acrylamid . Ammoniumpersulfat og TEMED sættes til acrylamid til at katalysere geldannelse . Typisk skal acrylamid viser tegn på polymerisation ( geldannelse ) 15 minutter efter er blevet tilsat ammoniumpersulfat og TEMED . Polymerisation der sker for hurtigt, er resultatet af høje mængder af ammoniumpersulfat . For lidt ammonium persulfat kan forårsage ufuldstændige eller ujævn polymerisering.
5.

Bekræft mængden af ​​de indlæste prøver. Høje koncentrationer af prøver kan bevæge sig trægt gennem gelen og reducere band opløsning. En prøve koncentration, der er lavt, kan ikke observeres efter gelen er farvet . Disse pletter har begrænsninger med hensyn til den minimale mængde prøve, der kan afbildes som et resultat af plet følsomhed.
6

Bekræft kvaliteten af ​​de indlæste prøver. Salte og andre forurenende stoffer til stede i en prøve kan påvirke bevægelse af prøven langs gelen. Elektroforese er resultatet af elektrisk strøm løber gennem en gel, der indeholder en strømledende buffer; høje saltkoncentrationer i prøven kan påvirke bevægelsen af ​​denne strøm gennem gelen. Din isolering af en prøve bør indeholde en rensning kit, der vil producere en forholdsvis ren prøve .
7.

anmeldelse litteratur eller skriftlig protokol at afgøre, om den korrekte SIDE blev brugt til at foretage forsøget . Den procentdel af acrylamid i PAGE er specifik for størrelsen af ​​den prøve, der skal testes. Litteraturen kan også give specifikke oplysninger med hensyn til opsætning af strømforsyningen og sats på prøve migration.
Hoteltilbud