Hvordan laver antistoffortyndinger for IHC

Kontroller og forberede antistoffet. Kontroller, at antistof er blevet rejst i den rigtige vært, og reagerer med den præcise version af proteinet (kendt som isoform eller splejse variant) , der bliver testet. Ved hjælp af en pipette forsigtigt tage en 10 mikroliter del af dette, og mærke som »personlig lager ".
P Hvis kun meget små mængder af antistof er til rådighed , skal du springe dette trin over.

Holde en personlig bestand antistof er rutinemæssig praksis i alle laboratorier , da det forhindrer krydskontaminering af den oprindelige bestand . Dispensere dette i en lys- beskyttet mikrofugeglas , eller en normal mikrofugerør som er pakket ind i aluminiumfolie for at beskytte mod direkte lys .

Hold dette rør på is , helst i en Esky med et lufttæt låg , igen for at minimere lys, som kan ødelægge antistoffet. Notér den oprindelige bestand koncentration (f.eks 100 enheder per milliliter , 1 milligram per mikroliter og så videre) på røret , herunder navnet på antistoffet og hvad eventuelle buffer det fortyndes i (fx serum , saltvand, eller vand osv.) .
2

Forbered fortynding buffer, også kendt som antistoffortyndingsmiddel . Kontroller, at dette er foreneligt med antistoffet og immunhistokemisk procedure , der anvendes, for eksempel , bør det ikke overskygge nogen fluorescens eller forhindre efterfølgende sekundært antistof mærkning. Lav en standard immunhistokemi fortynding ( også det blokerende buffer) ved at blande 1X phosphatpufret saltopløsning med 1% Triton - X100 , 10% føtalt kalveserum og 0,2% natriumazid.
3

titrere antistof. Med den givne koncentration af antistof i den personlige lager (udtrykt som koncentrationsenheder såsom mikrogram per mikroliter ) bestemme mængden af antistof, der kræves for at opnå 10 mikrogram antistof.

Opsæt en fortyndingsrække ved pipettering et volumen svarende til 2 mikrogram antistof (fx X- mikroliter ) i 100 mikroliter fortynder og bland grundigt ved pipettering op og ned. Fra denne start fortynding tage de samme X mikroliter og tilføjer, at en senere 100 mikroliter fortyndingsmiddel. Gentag dette, indtil 8-10 fortyndinger (eller en serie ) består .

Sidste rør vil derfor have den laveste koncentration og være " mættet " koncentration, der vil generere det højeste niveau af signalet under eksperimentet. Imidlertid vil den ideelle koncentration være lidt mere koncentreret end dette, så der ikke er for meget frembringes , hvilket kan forårsage baggrund fejl.

Mærk rørene korrekt med de nye fortyndede koncentrationer.